Análises Microbiológicas

3.5.1 Carbono da biomassa microbiana

Para a determinação do carbono da biomassa microbiana, utilizou-se o método de fumigação – extração proposto por Vance et al. (1987). O fator de correção (Kc) utilizado foi de 2,64. Foram pesados 10 g de solo úmido em béquer, sempre duas amostras, uma para ser fumigada e outra para ser extraída de imediato, considerando o controle. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Para fumigação, as amostras foram colocadas em dessecador, previamente forrado com papel de filtro úmido para manter a umidade, um béquer com aproximadamente 30 mL de água destilada e outro com 50 mL de clorofórmio isento de álcool e contendo pérolas de vidro dispostas no seu interior. O conjunto foi submetido a vácuo, por 5 minutos, até o clorofórmio borbulhar. Em seguida, o dessecador contendo as respectivas amostras fumigadas foi mantido por 24 horas em estufa BOD a 28°C. Após esse período, foram retirados do dessecador os béqueres com a água destilada e com o clorofórmio e, também, o papel de filtro umidecido, deixando-se apenas os béqueres contendo o solo. A seguir, foi realizado vácuo para a remoção dos vapores de clorofórmio. A extração das amostras fumigadas e não fumigadas foi feita transferindo-se o solo para erlenmeyer de 125 mL e adicionando-se 50 mL de solução extratora de sulfato de potássio 0,5 M. Foram agitados por uma hora em agitador horizontal e a mistura foi filtrada em papel de filtro, sendo o filtrado armazenado em câmara fria (7°C) até o momento da determinação. Para a determinação, foram pipetados 8 mL do filtrado em erlenmeyer de 125 mL, 2 mL de solução de dicromato de potássio 0,066 M, 5 mL de ácido ortofosfórico 88% e 10 mL de ácido sulfúrico 98%. A mistura foi submetida ao banho-maria em ebulição por uma hora. Com água destilada, o volume foi ajustado para 75 mL. Depois que a solução atingiu a temperatura ambiente, foram adicionados 3 gotas de solução de difenilamina 1% e titulou-se com solução de sulfato ferroso amoniacal 0,033 M em solução de ácido sulfúrico 0,4 M, até a mudança da cor azul para verde garrafa. Em cada avaliação foi

feito um branco com 8 mL de sulfato de potássio 0,5 M em substituição ao extrato de solo.

3.5.2 Nitrogênio da biomassa microbiana

O conteúdo de nitrogênio da biomassa microbiana do solo foi determinado mediante o emprego da metodologia proposta por Brookes et al. (1985), a partir de amostras de solo fumigadas e não fumigadas, ou seja, mesmos extratos obtidos para determinação do carbono da biomassa. O fator de correção (Kn) utilizado foi de 0,45. Para a determinação, foram colocados 5 mL do filtrado e 5 mL da mistura digestora em um tubo digestor. Digeriu-se, por três horas, até se obter uma solução clara, levemente azulada. A seguir, a parede do tubo foi lavada com água destilada e depois de frio, foram acrescentados 15 mL de NaOH 10 M, levando-se ao destilador, sendo recolhidos 40 mL em erlenmeyer de 50 mL, contendo 5 mL de solução indicadora, previamente pipetada. Por último, titulou-se o destilado com solução de ácido sulfúrico 0,001 M (ou 0,002N) até a mudança da cor verde para rosa. Em cada avaliação, determinou-se um branco substituindo-se o extrato por 5 mL de sulfato de potássio 0,5 M.

3.5.3 Fósforo da biomassa microbiana

O fósforo da biomassa microbiana foi determinado pelo método proposto por Brookes et al. (1982). Foram pesados 2,5 g de solo úmido em béquer, sempre três amostras, uma para ser fumigada, outra para adição de fosfato de potássio (KH2PO4) e outra para ser extraída de imediato, considerando o controle. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Para fumigação, as amostras foram colocadas em dessecador, previamente forrado com papel de filtro úmido para manter a umidade, um béquer com aproximadamente 30 mL de água destilada e outro com 50 mL de clorofórmio isento de álcool e contendo pérolas de vidro dispostas no seu interior. Este conjunto foi submetido a vácuo por 5 minutos, até o clorofórmio borbulhar. Em seguida, o dessecador contendo as respectivas amostras fumigadas foi mantido, por 24 horas, em estufa BOD a 25°C.

Após esse período foram retirados do dessecador os béqueres com a água destilada e com o clorofórmio e, também, o papel de filtro umidecido, deixando-se apenas os béqueres com os solos. A seguir, realizou-se novamente o vácuo para a remoção dos vapores de clorofórmio. As amostras não fumigadas e as amostras contendo 25 µg P (KH2PO4) g-1solo seco também foram incubadas, por 24 horas, em estufa BOD, a 25°C. A extração das amostras fumigadas, não fumigadas e contendo P foi feita transferindo-se o solo para erlenmeyer de 125 mL, onde foram adicionados 50 mL de solução extratora de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,5M pH 8,5. Agitou-se por trinta minutos em agitador horizontal e filtrou-se a mistura em papel de filtro, cujo filtrado foi armazenado em câmara fria (7°C) até o momento da determinação. Para a determinação do fósforo da biomassa microbiana foi utilizado o método proposto por Watanabe e Olsen (1965). Foram pipetados 2 mL do filtrado em tubo de ensaio, onde foram adicionados 0,2 mL de solução de ácido sulfúrico 5 N e 0,8 mL de reagente B. Todos os tubos foram agitados e submetidos a incubação em banho-maria, a 45°C, por vinte minutos. Após a incubação, foi feita a leitura das amostras no espectrofotômetro em absorbância de 820 nm. O mesmo procedimento foi utilizado para os três tipos de amostras (fumigada, não fumigada e a com adição de P). Em cada avaliação foi feito um branco com 2 mL de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,5M pH 8,5, em substituição ao extrato de solo.

3.5.4 Atividade respiratória microbiana

A atividade respiratória microbiana (carbono do CO2 liberado) foi determinada segundo metodologia descrita por Rezende et al. (2004a). Em frasco com tampa, com capacidade para 2,5 L, colocou-se 100 g de solo úmido. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Em seguida, foram dispostos no interior do frasco dois béquers, um contendo 10 mL de água destilada e outro contendo 10 mL de NaOH 0,5 M. Os frascos foram vedados com filme plástico seguido da tampa e foram mantidos à 28°C. Após o sétimo dia de incubação, foi retirado o béquer contendo NaOH, ao qual foram adicionados 2 mL de solução de cloreto de bário 30%, três gotas de solução de fenolftaleína 1%, titulando-se com solução de HCl 0,5 M, até a viragem da cor rosa

escuro para incolor. Foram incluídos 6 frascos controle (sem solo), somente com os referidos béquers, cujo resultado final foi descontado.

3.5.5 Atividade nitrificante

A atividade nitrificante do solo foi determinada mediante o emprego da metodologia proposta por Schmidt e Belser (1994). Foram pesados 10 g de solo úmido em placas de petri, com duas repetições de cada amostra de solo, uma com e outra sem adição de 160µg N-NH4((NH4)2SO4) g-1 solo seco. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Depois, as amostras foram mantidas em estufa BOD, por 21 dias, a 30°C. Após o período de incubação, 8 g de solo de cada amostra, com e sem N-NH4, foram pesadas e transferidas para um erlenmeyer de 125 mL. A extração das amostras foi feita adicionando-se 50 mL de solução extratora, cloreto de potássio (KCl) 1M. Agitou-se por uma hora, em agitador horizontal, e filtrou-se a mistura em papel de filtro, cujo filtrado foi armazenado em câmara (7°C) fria até o momento da determinação. Para a determinação por titulação, foi utilizado o método proposto por Keeney e Nelson (1982). Para determinação inicial da amônia (NH4), em um tubo digestor com saída lateral, foram acrescentados 10 mL do filtrado que foi levado ao destilador onde foi acrescentado, pela saída lateral do tubo, 0,2 g de óxido de magnésio. Em seguida, foram recolhidas 40 mL, em erlenmeyer de 50 mL, contendo 5 mL de solução indicadora, previamente pipetada. Titulou-se o destilado com solução de ácido sulfúrico 0,0025 M até a mudança da cor verde para rosa. Utilizando-se as mesmas amostras que estavam nos tubos digestores com saída lateral e, após o seu resfriamento, foi acrescentado 1 mL de ácido sulfâmico que foi levado ao destilador onde foi acrescentado, pela saída lateral do tubo, 0,2 g de liga devarda. Em seguida, recolheu-se 40 mL, em erlenmeyer de 50 mL contendo 5 mL de solução indicadora, previamente pipetada. Titulou-se o destilado com solução de ácido sulfúrico 0,0025 M até a mudança da cor verde para rosa. Determinou- se assim a presença de nitrato (NO3) nas amostras. O mesmo procedimento foi utilizado para as amostras com e sem N-NH4. Em cada avaliação, determinou-se um branco substituindo-se o extrato por 10 mL de cloreto de potássio (KCl) 1M .

3.5.6 Atividade solubilizadora de fosfato

Para a atividade solubilizadora do solo, foram pesados 10 g de solo úmido em placas de petri, com duas repetições de cada amostra de solo, uma sem e outra com adição de 38,4 mg fluorapatita g-1 solo seco. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. As amostras foram mantidas em estufa BOD, por 30 dias, a 30°C. Para a extração e determinação foi utilizado o método proposto por Watanabe e Olsen (1965). Após o período de incubação, 0,6 g de solo de cada amostra, com e sem P, foram pesadas e transferidas para um erlenmeyer de 125 mL. A extração das amostras foi feita adicionando-se 12 mL de solução extratora de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,5 M pH 8,5. Agitou-se, por trinta minutos, em agitador horizontal e filtrou-se a mistura em papel de filtro, cujo filtrado foi armazenado em câmara fria (7°C) até o momento da determinação. Foram pipetados 2 mL do filtrado em tubo de ensaio, adicionou-se 0,2 mL de solução de ácido sulfúrico 5 N e 0,8 mL de reagente B. Todos os tubos foram agitados e submetidos a incubação em banho-maria, a 45°C, por vinte minutos. Após a incubação, a leitura das amostras foi feita em espectrofotômetro, na absorbância de 820 nm. O mesmo procedimento foi utilizado para os dois tipos de amostras (sem e com adição de P). Em cada avaliação foi feito um branco com 2 mL de bicarbonato de sódio (NaHCO3) 0,5M pH 8,5, em substituição ao extrato de solo.

3.5.7 Atividade enzimática da celulase

A determinação da atividade da enzima celulase foi realizada com base no procedimento de Kanazawa e Miyashita (1986). Pesou-se 1 g de solo úmido em tubo de ensaio. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Adicionaram-se 0,2 mL de tolueno e 10 mL de substrato carboximetilcelulose (CMC). Os tubos foram agitados e mantidos em banho-maria, a 50°C, por quatro horas. Para cada amostra, fez-se um controle acrescentando 0,2 mL de tolueno e 10 mL de substrato carboximetilcelulose (CMC). Após o período de incubação, o líquido dos tubos foi passado para tubos de centrífuga e levados para centrifugação, por dez minutos, em 10.000 rotações por

minuto (rpm). O sobrenadante foi, então, armazenado em frascos de penicilina, onde foram armazenados em câmara fria (7°C). Pipetaram-se 1 mL do centrifugado em tubos de ensaio ao qual foi adicionado 1 mL de reagente cúprico alcalino e agitado vigorosamente. Os tubos foram tampados com filme plástico e levados para incubação em banho-maria, em ebulição, por vinte minutos. Após o período de incubação, foram acrescentados 1 mL de reagente arsenomolibtado e 5 mL de água destilada. Os tubos foram agitados novamente e, então, efetuou-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro com comprimento de onda correspondente a 660 nm. Os resultados foram calculados a partir de uma curva padrão com solução de glicose.

3.5.8 Atividade enzimática da urease

A determinação da atividade da enzima urease foi realizada com base no procedimento de McGarity e Myers (1967). Foram pesados 2 g de solo úmido em tubo de ensaio. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Adicionaram-se 0,1 mL de tolueno, que foi deixado em repouso, por 15 minutos, e foram acrescentados 2 mL de tampão fosfato 0,1 M pH 6,7 e 1 mL de uréia 10%. Os tubos foram agitados e incubados em banho-maria, a 37°C, por três horas. Para cada amostra, fez-se um controle, acrescentando-se 1 mL de uréia após a incubação. Após o período de incubação, acrescentaram-se 3 mL de água destilada e agitaram-se os tubos vigorosamente. O líquido dos tubos foi passado para tubos de centrífuga e levados para centrifugação, por dez minutos, em 10.000 rotações por minuto (rpm). O sobrenadante foi, então, armazenado em frascos de penicilina, onde foram armazenados em câmara fria (7°C). Foram pipetados 0,1 mL do centrifugado em tubos de ensaio. Adicionaram-se 2,1 mL de água destilada, 0,5 mL de fenolato e 0,3 mL de hipoclorito 0,9% de cloro ativo. Agitaram-se vigorosamente os tubos e efetuou-se nova incubação, agora em temperatura ambiente, por uma hora. Após o período de incubação, foi feita leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda correspondente a 630 nm. Os resultados foram calculados a partir de uma curva padrão com solução de sulfato de amônia.

3.5.9 Atividade enzimática da protease

A determinação da atividade da enzima protease foi realizada com base no procedimento de Nannipieri et al. (1979). Pesou-se 1 g de solo úmido em tubo de ensaio. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Adicionaram-se 2,5 mL de solução de caseína 1% em tampão tris-HCl 0,1M pH 8,1 e incubou-se em banho-maria, a 52°C, por 1 hora. Após este período, foi acrescentado 1,0 mL de ácido tricloroacético 17,5% e os tubos foram agitados vigorosamente. Para cada amostra, fez-se um controle acrescentando-se 2,5 mL de solução de caseína 1% em tampão tris-HCl 0,1M pH 8,1, após a incubação. O líquido foi passado para tubos de centrífuga e levados para centrifugação, por dez minutos, em 10.000 rotações por minuto (rpm). O sobrenadante foi, então, recolhido em frascos de penicilina, onde foram armazenados em câmara fria (7°C). Pipetaram-se 1 mL do centrifugado em tubos de ensaio e adicionaram-se 7,0 mL de solução de Na2CO33,7% e 1,0 mL de solução CuSO4.5H2O 0,06%. Agitaram-se vigorosamente os tubos e efetuou-se nova incubação, agora em temperatura ambiente, por 30 minutos. Após o período de incubação, acrescentaram-se 1 mL de reagente de Folin (1:4) e incubou-se, novamente, agora em banho-maria, a 37oC, por 5 minutos. Após o período foi feita leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda correspondente a 578 nm. Os resultados foram calculados a partir de uma curva padrão com solução de tirosina.

3.5.10 Atividade enzimática da fosfatase ácida

A determinação da atividade da enzima fosfatase ácida foi realizada com base no procedimento de Tabatabai e Bremner (1969). Foram pesados 0,2 g de solo úmido em tubo de ensaio. A capacidade de campo foi ajustada para 60%. Adicionaram-se 4 mL de tampão acetato 0,1 M, pH 5,4 e colocaram-se os tubos em banho-maria, à 37°C, por 5 minutos, para equilibrar a temperatura. Foram adicionados 1 mL de solução de p- nitrofenil fosfato 30 mM, agitando-os levemente. O período de incubação foi cronometrado por, no máximo, trinta minutos. Após a incubação, acrescentou-se 1 mL

de solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,5 M e 4 mL de hidróxido de sódio (NaOH) 0,5 M e agitou-se vigorosamente a mistura nos tubos. Filtrou-se o conteúdo em papel de filtro “F. Maia”, faixa azul, nº 42, fazendo, em seguida, a leitura da absorbância do filtrado em espectrofotômetro no comprimento de onda correspondente a 405 nm. Para cada amostra, fez-se um controle acrescentando-se a solução de p-nitrofenil fosfato 30 mM, após a adição da solução de cloreto de cálcio 0,56 M e da solução de hidróxido de sódio 0,5 M. Os resultados foram calculados a partir de uma curva padrão com solução de p-nitrofenol.