2.4.1 – Cafeína / trigonelina
O método utilizado para a determinação do teor em cafeína e trigonelina baseou-se na norma ISO 10095 (1992).
32 Pesou-se 1g ± 0,1 mg de café verde moído, adicionaram-se 4,5 ± 0,5g de óxido de magnésio e 100 mL de água. Pesou-se esta mistura, que foi colocada num banho de água, a 90 ± 1oC, com agitação contínua, durante 20 minutos. Após arrefecimento, pesou-se novamente para se verificar a conservação da massa. Seguiu-se então a filtração através de um filtro Whatman no1, sem lavagem do resíduo sólido. Em seguida, transferiu-se uma alíquota de 2 mL para um balão volumétrico de 10 mL e levou-se à marca com água destilada. Por fim, homogeneizou-se a mistura para depois ser filtrada por um filtro 0,45 µm, ficando pronta para análise.
Utilizou-se um cromatógrafo Beckman Coulter, coluna Spherisorb ODS2 (Waters) com 5 µm de poro, 4,6 mm de diâmetro interno e 250 mm de comprimento. A fase móvel tinha a seguinte constituição: tampão fosfato 0,02 M e acetonitrilo (9:1), sendo o fluxo utilizado de 1 mL min-1. Relativamente à temperatura da coluna, foi mantida a 25oC e o comprimento de onda utilizado foi de 254 nm. Após estabilização do fluxo da fase móvel foram injetadas alíquotas de 20 µL do extrato de cafeína/trigonelina. Terminadas as injeções das amostras em estudo passou-se à injeção de igual volume de solução padrão de cafeína/trigonelina.
A quantificação deste alcaloide foi feita recorrendo a uma curva padrão obtida a partir de soluções de concentração variando entre 0,031 e 1 mg mL-1.
2.4.2 – Ácidos clorogénicos
Para a quantificação dos ácidos clorogénicos no café verde, seguiu-se o método utilizado por Correia (1990).
Pesou-se 1g ± 0,1 mg de café verde moído e adicionaram-se 10 mL de uma solução de metanol:água (40:60), procedendo-se depois a uma agitação mecânica durante 30 minutos. Em seguida, centrifugou-se a mistura durante 5 minutos a cerca de 25oC, a 10000 rpm. Terminado este período, o líquido sobrenadante foi decantado para um balão aferido de 100 mL. A extração foi então repetida mais três vezes para se garantir a completa remoção dos ácidos clorogénicos, e os extratos obtidos foram adicionados ao mesmo balão. Em seguida, esta mistura foi tratada com as soluções de Carrez I1 e II2 (1 mL de cada) para clarificação. O volume do balão foi completado com solução de metanol:água (40:60) e, após repouso durante 15 minutos, filtrou-se a mistura através de um filtro Whatman nº1, sendo retirada do filtrado uma alíquota de 10 mL, a qual foi novamente filtrada com um filtro de 0,45 µm antes da injeção no cromatógrafo.
A separação efetuou-se com o mesmo cromatógrafo e coluna utilizados para a cafeína/trigonelina.
A composição da fase móvel utilizada foi a seguinte: Solução tampão de citrato tripotássico 0,01 M (pH 2,5) – solvente A e metanol a 100% - solvente B. O fluxo utilizado foi de 1 mL min-1 e o programa do gradiente de eluição foi o apresentado na Tabela 2.1.
A deteção foi feita a 330 nm (com varrimento do espetro entre 200 e 400 nm), tendo-se injetado volumes de 20 µL de cada extrato.
33
Tabela 2.1 - Programa de gradiente de eluição para separação dos ácidos clorogénicos no café verde (Correia,
1990).
Tempo (minutos) Solvente A (%) Solvente B (%)
0 80 20 5 80 20 10 75 25 15 70 30 20 60 40 25 55 45 30 50 50 35 40 60 40 30 70 45 80 20
Dada a inexistência de mais padrões de ácidos clorogénicos, efetuou-se a isomerização do padrão existente. Posto isto, colocaram-se 100 mg do padrão (ácido 5-cafeoilquínico), obtido comercialmente, em 10 mL de água destilada e ajustou-se a pH 8, com uma solução de hidróxido de amónio (4 M). Em seguida, aqueceu-se durante 30 minutos, em banho de água fervente. Depois de arrefecida, procedeu-se ao acerto do pH para 2,5-3, com HCl 8 M. Depois filtrou-se a amostra que, por estar muito concentrada, foi necessária a sua diluição de 1:10 com água. Após filtração, efetuaram-se as respetivas injeções. Esta isomerização do 5-CQA permitiu identificar mais dois compostos que correspondem aos seus isómeros, o 3-CQA e o 4-CQA.
1 – Solução de Carrez I: Solução aquosa de acetato de zinco di-hidratado (ZnCH
3COO)2.2H2O) e ácido acético glacial
(10,95g + 1,5 ml, respetivamente, para 50 ml de solução).
2 – Solução de Carrez II: Solução aquosa de hexacianoferrato II de potássio tri-hidratado (K
4[Fe(CN)6].3H2O) (5,3 g para 50
34 A curva de calibração foi obtida a partir do 5-CQA, com concentrações variando entre 0,0156 e 0,5 mg mL-1, no entanto, a quantificação foi feita assumindo as áreas dos picos como referencial e comparando-as com a do padrão 5-CQA. Para quantificar cada um dos isómeros, utilizou-se a equação de Trugo e Macrae (1984):
Os símbolos da expressão anterior têm o seguinte significado: c – Concentração do isómero a quantificar, em mg cm-3;
Fr – Fator de resposta do padrão 5-CQA, em mg cm-3 por unidade de área; Ɛ1 – Coeficiente de absorção molar do padrão 5-CQA, em dm3 mol-1 cm-1; Ɛ2 – Coeficiente de absorção molar do isómero a quantificar em dm3 mol-1 cm-1; Mr1– Massa molar do ácido 5-CQA;
Mr2– Massa molar relativa do isómero em estudo (CQA = 354,1 g mol-1); A – Área do pico do isómero a quantificar.
Os coeficientes de absorção molar (Ɛ) utilizados foram aqueles mencionados por Trugo e Macrae (1984), expressos em dm3 mol-1 cm-1, que são os seguintes: 3-CQA – 18400, 4-CQA – 18000 e 5-CQA – 19500, para o comprimento de onda de 330 nm.
2.4.3 – Ácidos hidroxicinâmicos
A análise dos ácidos hidroxicinâmicos baseou-se, com as alterações necessárias, no método descrito por Andrade et al. (1997) e Casal et al. (1999).
Pesou-se 1 g de café verde moído, adicionaram-se 12 mL de solução de metanol:água (40:60) e submeteu-se esta mistura a uma agitação mecânica, durante 2h, na ausência de luz. O extrato foi então centrifugado, durante 30 minutos, a 5000 rpm. Em seguida, o sobrenadante foi concentrado a pressão reduzida num rotavapor, a 40oC, até se atingir um volume final de cerca de 2 mL. Após este passo, a solução foi hidrolisada com 2 mL de NaOH (2 M) e submetida a agitação magnética, durante 4h, na ausência de luz. Passou-se então ao acerto do pH para 7 com HCl 8M. Os ácidos hidroxicinâmicos foram extraídos recorrendo-se a uma extração líquido-líquido com acetato de etilo (3 x 10 mL). Agitou-se magneticamente a solução durante 1 minuto e seguiu-se a centrifugação durante 5 minutos a 5000 rpm, com evaporação do acetato de etilo a pressão reduzida. Por último, o resíduo foi dissolvido em 7 mL de metanol, sendo depois filtrado e injetado na coluna do HPLC em alíquotas de 20 µL.
35 A identificação dos ácidos hidroxicinâmicos foi também efetuada através do cromatógrafo Beckman Coulter, coluna Spherisorb ODS2 (Waters) com 5 µm de poro, 4,6 mm de diâmetro e 250 mm de comprimento. A fase móvel era constituída por uma solução A contendo água:ácido fórmico (19:1) e uma solução B contendo metanol a 100%. Aplicou-se um fluxo de 1 mL min-1 à fase móvel e o gradiente utilizado foi o apresentado na Tabela 2.2.
O comprimento de onda utilizado foi de 320 nm e a quantificação foi feita para os ácidos cafeico, p-cumárico e ferúlico, por serem estes os padrões disponíveis, sendo esta a sequência apresentada nos cromatogramas. Assim sendo, injetaram-se alíquotas de 20 µL de cada extrato de café verde proveniente das amostras em estudo e das soluções padrão.
A quantificação dos ácidos hidroxicinâmicos foi feita recorrendo a curvas padrão obtidas a partir de soluções de ácido ferúlico, cafeico e p-cumárico com concentrações variando entre 0 a 0,4 mg mL-1.
Tabela 2.2 - Programa de gradiente de eluição para separação dos ácidos hidroxicinâmicos no café verde
(Andrade et al., 1997, 1998; Casal et al., 1999).
Tempo (minutos) Solvente A (%) Solvente B (%)
0 85 15 10 75 25 25 70 30 30 65 35 34 50 50 41 30 70 43 25 75 47 20 80 51 85 15
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