Analise cromossômica e Montagem dos Cariótipos

As lâminas foram analisadas ao microscópio óptico Zeiss Axiostar, com oculares de 10X e objetivas de 10X, 40X e 100X, seguindo a iluminação de Köeler. Em seguida, foram escolhidas as melhores metáfases, para serem fotografadas digitalmente. As metáfases de bandeamento clássico foram capturadas em um microscópio Olympus, e montadas de acordo com a morfologia e em ordem decrescente de tamanho com o sistema de captura de imagem e montagem de cariótipos SpectraView® da Applied Spectral Imaging (ASI). Para a analise da FISH, as imagens digitais foram obtidas em um microscópio Axiophot, através de uma câmera CCD Zeiss Axiocam. Após a análise das imagens foi possível mapear o genoma do Hylaeamys megacephalus (2n=54) no cariótipo da espécie em estudo, o que permitiu a análise dos rearranjos ocorridos entre as espécies.

4. RESULTADOS

Todas as amostras de Hylaeamys megacephalus coletadas na Serra dos Carajás, município de Parauapebas/PA foram analisadas por citogenética clássica. O que resultou na co-autoria de um artigo cientifico (Apêndice), já publicado. No presente artigo houve a produção de sondas cromossômicas inteiras, no Centro de Recurso para Gênomica Comparativa do Departamento de Medicina Veterinária, da Universidade de Cambridge (UK). Essas sondas foram produzidas, por Citometria de Fluxo, a partir de cultura de fibroblastos, de dois espécimes de HME, uma fêmea adulta com 2n=54/NF=62 e outro, um feto, com 2n=50/NF=62. Essas sondas foram utilizadas no mapeamento de Cerradomys langguthi (2n=46/NF=62) e foram utilizadas para a conclusão do presente trabalho.

Já os espécimes de Hylaeamys oniscus, apresentam 2n= 52/NF=62, sendo 38 cromossomos autossômicos acrocêntricos e 12 cromossomos autossômicos de dois braços. O cromossomo X é acrocêntrico de tamanho grande e o Y é

acrocêntrico médio. O bandeamento G (Figura 9 - A) permitiu o pareamento de todos os cromossomos. O padrão de bandeamento C (Figura 9 - B) mostra que a heterocromatina constitutiva (HC) está presente na região centromérica dos 25 pares autossômicos. O cromossomo X também se apresentou heterocromático na região centromérica, sendo o cromossomo Y quase todo heterocromático.

Figura 9. Padrões de bandeamento G (A) e padrões de bandeamento C (B) em Hylaeamys oniscus (2n= 52/NF=62)

Os 24 picos de Hylaeamys megacephalus (HME) foram todos hibridizados em metáfases de H. oniscus (HON). Os resultados mostram que todos os 24 picos mantiveram sintenia conservada no cariótipo de HON (Figura 10A), sendo que 22 picos hibridizaram em cromossomos inteiros e dois picos (HME 14 e 19) hibridizaram em associação, correspondendo ao par 20 de HON (Figura 10B).

Figura 10. Hylaeamys oniscus: A – Bandeamento G mapeado com picos de HME; B – Hibridização dos picos que correspondem ao cromossomos 14 e 19 de HME.

5. DISCUSSÃO

Como já mencionado neste trabalho, os estudos com pintura cromossômica em roedores ainda são insuficientes se compararmos o numero de espécies que a ordem possui. Romanenko et al. (2012) visando entender a evolução cromossômica da ordem Rodentia destacaram tendo sido estudados menos de 100 espécies por essa técnica. Nagamachi et al. (2013) adicionaram a esses grupos de espécies estudados as espécies Hylaeamys megacephalus e Cerradomys langguthi.

Em nosso trabalho foram estudados comparativamente os cariótipos de Hylaeamys megacephalus (HME) e Hylaeamys oniscus (HON), utilizando técnicas de citogenética clássica e molecular. A utilização conjunta dessas técnicas nos permitiu determinar as características cromossômicas das espécies em estudo, permitindo assim uma análise comparativa das homeologias existentes entre as duas espécies do gênero Hylaeamys.

O cariótipo de H. oniscus corrobora com o cariótipo apresentado por Maia (1990), apresentando similaridade com o descrito por Volobouev & Aniskin (2000) para espécimes de Hylaeamys megacephalus da Amazônia peruana com relação ao número diploide e fundamental. Os resultados obtidos por bandeamentos clássicos (Bandeamentos G e C) no presente trabalho são pioneiros para HON não possibilitando, desta forma, qualquer análise comparativa. No entanto nos permite discordar com Musser et al. (1998) quando os mesmos inferem que H. oniscus seria sinonímia de H. laticeps (HLA), pois ao compararmos nossos resultados com os já descritos na literatura para H. laticeps (SVARTMAN & ALMEIDA,1992; GEISE & PEREIRA, 2008) e analisarmos o padrão de bandeamentos bem como a morfologia dos cromossomos e número diplóide verifica-se que trata-se de duas espécies distintas. O cariótipo proposto por Svartman & Almeida (1992) para HLA (2n=54 e NF=62) possui 42 cromossomos autossômicos acrocêntricos e 10 cromossomos autossômicos de dois braços, o assemelha-se com o cariótipo descrito para HME proposto por Nagamachi et al, (2013). Já no trabalho de Geise & Pereira (2008), houve a identificação apenas do numero diploide (2n=48), o que difere não só do HON proposto nesse trabalho, bem como do proposto por Svartman & Almeida (1992). O mesmo acontece ao compararmos o cariótipo de H. yunganus descrito por Volobouev e Aniskin (2000), onde possui o número diploide (2n=58), com 50 cromossomos autossômicos acrocêntricos e 6 cromossomos autossômicos de dois braços o que o difere de Hylaeamys oniscus.

Na literatura ainda não se tem muita informação sobre H. perenensis tendo apenas o seu 2n (52) descrito. Com relação a H. tatei e H. acritus, não podemos sequer comparar a nível de número diplóide por não existir na literatura essas informações.

Ao compararmos o cariótipo de Hylaeamys oniscus com o cariótipo de Hylaeamys megacephalus (2n=54) descrito por Nagamachi et al. (2013), verifica-se que a diferença do número diploide deve-se a fusão dos pares 19 e 14 de HME resultando, em H. oniscus, um par de cromossomos metacêntrico de tamanho médio (par 20). Essa fusão só foi possível ser detectada com certeza, graças à utilização das sondas de cromossomo total de Hylaeamys megacephalus (NAGAMACHI et al., 2013).

Ao compararmos o cariótipo de HON com o de Cerradomys langguth (CLA) mapeado com sondas de HME (NAGAMACHI et al., 2013), verificamos que CLA também apresenta a associação 19/14 porém, com inversão (19/14/19) e associado com vários outros cromossomos de HME (5/19/14/19/5/[16,17]/[13,22]/3/[13/22]/20) formando o par 1, o maior cromossomo de CLA. Na análise comparativa entre os cariótipos de HON e CLA em relação ao HME, verificamos que os cromossomos 15, 18, 23, 24, 25 e 26 de HME são compartilhados na forma livre entre HON e CLA, porém, em CLA os pares 23 a 26, que são de dois braços em HME e HON, são acrocêntricos em CLA, mostrando a ocorrência de inversões pericêntricas diferenciando o cariótipo de CLA. Os cromossomos HME 15 e 18, que correspondem aos cromossomos HON 14 e 17 e CLA 12 e 16, são compartilhados entre as 3 espécies sem qualquer rearranjo visível. É interessante fazer o mapeamento de outras espécies da tribo Oryzomyini (Sigmodontinae) para verificar algumas questões que surgiram da análise comparativa entre HME, HON e CLA: 1) Se esses dois pares compartilhados sem nenhum rearranjo constitui uma característica simplesiomórfica ou sinapomórfica para a tribo; 2) Se a forma de dois braços dos pares 23 a 26, compartilhados por HME e HON é primitiva ou derivada em relação à forma acrocêntrica encontrada em CLA; 3) Se a associação 19/14 presente em HON e compartilhada com inversão por CLA é primitiva ou derivada. Essas questão vão poder ser resolvidas ao longo do tempo, com o mapeamento das diferentes espécies de Tribo Oryzomyni e de outras Tribos da subfamília Sigmodontinae.

Este trabalho junto com Nagamachi et al. (2013), é um marco para estudos de filogenia cromossômica do gênero Hylaeamys. Para isso se faz necessário o mapeamentos das outras cinco espécies de Hylaeamys, para que se possa entender a diversificação cromossômica das diferentes espécies deste gênero.

6. CONCLUSÃO

Ao término desse trabalho, foi possível chegarmos a algumas conclusões a respeito da caracterização de Hylaeamys megacephalus (HME) e Hylaeamys oniscus (HMO):

1. A diferença nos cariótipos das espécies deve-se a uma fusão do cromossomo 19 e 14 de HME, o que resultou em um par de cromossomos metacêntrico de tamanho grande em HON;

2. A análise comparativa entre HME, HON e CLA nos fez entender a importância de fazer o mapeamento de outras espécies da tribo Oryzomyini (Sigmodontinae) para elucidar encontrar as homeologias cromossômicas e entender os mecanismos de rearranjos que ocorreram diferenciando os cariótipos das diferentes espécies.

3. Para entendermos a filogenia cromossômica do gênero Hylaeamys, faz-se necessário o mapeamentos das outras cinco espécies do gênero.

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