Com o objetivo de avaliar a ação dos particulados contra o crescimento de S.
aureus, foi feito um teste de desafio, inoculando o microrganismo na emulsão e
acompanhando seu crescimento ao longo do tempo. Para isso, o preparo das emulsões foi realizado em condições assépticas, a fim de garantir que única e exclusivamente o crescimento do S. aureus iria acontecer. Todos os utensílios usados foram previamente esterilizados, assim como os meios, o telurito, as pipetas, as ponteiras, a água ultra-pura, as soluções salinas, a alça do Ultra-turrax e os tubos em que as emulsões foram acondicionadas para posterior avaliação. O óleo de soja utilizado foi aberto no momento da análise, dentro da câmara de fluxo laminar, assim como as placas de Petri estéreis.
A partir do Combase Predictor (www.combase.cc), banco de dados utilizado para prever o crescimento e inativação de microrganismos em diferentes condições em alimentos, previu-se que o crescimento logarítmico do S. aureus utilizando as condições mais próximas ao presente trabalho. Um aumento no crescimento para esta bactéria poderia ocorrer entre 40 e 50 horas à temperatura ambiente (25ºC), sendo este o início da fase logarítmica da curva de crescimento. Como controle, realizou-se uma contagem de mesófilos totais, a fim de certificar que a amostra não estava contaminada.
A análise de S. aureus foi feita diretamente em placas, por plaqueamento em superfície. O meio de cultura utilizado para análise foi o Ágar Baird-Parker (BPA) com emulsão gema de ovo:salina (1:1 m/m) e solução aquosa de telurito de potássio 1% como suplementos. Primeiramente, o meio foi esterilizado e resfriado, sendo adicionados dos suplementos estéreis assepticamente. Para o preparo da emulsão de gema de ovo, os ovos foram mergulhados em etanol 70% por 10 minutos, foram flambados e abertos dentro da câmara de fluxo laminar, onde a gema foi transferida para um recipiente esterilizado tarado o qual foi adicionado de solução salina 0,85% estéril, obtendo outra de concentração 1:1 (m/m). O conteúdo foi misturado com a utilização de uma bagueta estéril. 5 mL dessa nova solução foram adicionadas ao meio BPA que também foi enriquecido com uma solução aquosa de telurito a 1%, esterilizada por filtração e armazenada em frasco escuro.
Por sua vez, o S. aureus foi adicionado em Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI), o qual ficou em incubação a 37ºC por 24 horas. Passado este tempo, uma alçada foi novamente transferida para outro tubo contendo o mesmo caldo e foi deixado por mais 24
horas, a fim de certificar que a bactéria se encontrava em boas condições de crescimento. A cepa do microrganismo foi lavada duas vezes com água peptonada 0,1% e centrifugada nestas duas vezes a 15.000 rpm por 10 minutos à 4ºC, sendo o sobrenadante descartado. Posteriormente o microrganismo foi padronizado pelo método de turbidez padrão (Escala McFalard). A concentração inicial de S. aureus foi de 101.
Após o preparo das emulsões, estas foram inoculadas com o microrganismo na concentração de 1% (m/m) - 150 µL de inóculo para 14,850 gramas de emulsão – e foram homogeneizadas com vórtex. O plaqueamento foi então realizado da diluição 10-1 na superfície de placas de BPA estéreis, previamente preparadas e secas em capela de fluxo laminar durante 30 a 60 minutos com as tampas parcialmente abertas. O inóculo foi espalhado com o auxílio de uma alça de Drigalsky até a completa absorção do líquido. Feito isso, as placas foram invertidas e incubadas a 37ºC por 48 horas. As colônias típicas de S. aureus circulares, pretas ou cinzas escuras, com diâmetro entre 2 a 3 mm, lisas e convexas foram contadas. Contagem de mesófilos e psicrotróficos também foram realizadas, a fim de garantir que não houve contaminação nas emulsões.
A partir dos resultados da Análise de S. aureus (Tabela 11), observa-se que as amostras com quitosana e com os particulados não diferiram entre si nem em relação ao tempo e nem entre si. No último dia foi possível verificar um aumento no crescimento do microrganismo estudado na amostra controle em relação às demais, indicando que o crescimento nas amostras contendo quitosana manteve-se inibido, assim como reportado na análise de MIC. O baixo crescimento se S. aureus pode ser justificado pela qualidade do inóculo desta bactéria, que se encontrava em concentração baixa e provavelmente com baixa quantidade de células bacterianas em bom estado físico e pelo pH das emulsões estar perto do limite mínimo para o crescimento do S. aureus (limite de pH para crescimento é entre 4,2 e 9,3), podendo justificar a pouca quantidade de colônias encontradas na análise. Por isso, faz- se necessário um estudo mais aprofundado no efeito das partículas in situ diretamente na bactéria em questão.
Como controle da análise, os tratamentos foram avaliados quanto sua esterilidade em relação ao microrganismo (sem adição do inóculo) e por contagem de aeróbios mesófilos e psicrotróficos totais; em ambas as análises não houve crescimento do S. aureus, indicando que as amostras estavam livres de contaminantes. Apesar do resultado pouco satisfatório desta análise, é curioso observar que tanto a amostra com solução de quitosana quanto com os
particulados comportaram-se de maneira semelhante nos 3 dias avaliados, ao contrário do observado in vitro.
Tabela 11 - Contagem obtida da Análise de S. aureus para os tempos observados para emulsão controle (CT), emulsão com quitosana pura (CS) e emulsões com os particulados (CS-TPP e CS-GN).
Contagem de S. aureus (UFC/g)
Amostra Dia 0 Dia 1 Dia 2
CT 2,1 x 101 ± 7,22Aa 3,7 x 101 ± 1,1 x 101Aa 4,0 x 101 ± 1,0 x 101Aa CS 1,3 x 101 ± 1,1 x 101Aa 2,0 x 101 ± 1,0 x 101Aa 1,4 x 101 ± 5,20Ba CS-TPP 1,1 x 101 ± 1,0 x 101Aa 2,2 x 101 ± 1,0 101Aa 1,7 x 101 ± 7,22Ba
CS-GN 3,33 ± 5,77Aa 1,3 x 101 ± 5,77Aa 1,2 x 101 ± 0,00Ba
Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes na mesma coluna diferem estatisticamente entre si (p < 0,05); letras minúsculas distintas na mesma linha representam médias significativamente diferentes entre si (p < 0,05).