Anisotropia de Fluorescência

Nesta técnica, luz polarizada é incidida sobre a amostra, de forma que somente os fluoróforos orientados na mesma direção que a luz polarizada absorvem energia, tornando- se excitados e subsequentemente emitindo luz. A livre movimentação das moléculas em solução altera a orientação relativa dos fluoróforos, fazendo com que a luz seja emitida em um plano de polarização diferente do incidente. Dessa forma, quando se mede a relação entre a luz emitida no mesmo plano da luz incidente (“vertical”) e a luz emitida no plano ortogonal (“horizontal”) é possível se inferir a velocidade de rotação das moléculas em solução (Figura 27).

87 Figura 27. Representação esquemática da detecção de anisotropia de fluorescência. De acordo como o arranjo experimental do equipamento, uma luz monocromática passa por um polarizador, sendo orientada em um único sentido para então ser incidida sobre a amostra. O detector irá medir a luz emitida pela molécula tanto no sentido paralelo ao de excitação quanto no ortogonal a ele.

Devido ao movimento Browniano, moléculas livres em solução sofrem um movimento de rotação dependente do tamanho da molécula. Quanto maior for a molécula mais lento será seu movimento, de modo que a luz emitida pelo fluoróforo continuará em maior parte no mesmo plano de polarização da luz incidente. A luz emitida conserva a polarização. Já moléculas menores, cuja rotação é mais acelerada, fazem com que a luz seja emitida pelos fluoróforos em todas direções, levando a uma maior despolarização da luz (INVITROGEN MANUAL, 2006). Uma consequência direta desse fenômeno é o fato de que, moléculas sofrem uma redução na sua velocidade de rotação a partir do momento em que interagem com algum ligante, pois o complexo de interação apresentará um tamanho maior do que a molécula sozinha. A Figura 28 abaixo caracteriza essa interação:

88 Figura 28. Representação esquemática da diferença na anisotropia de fluorescência entre

moléculas pequenas e complexos formados.

Dentro desse contexto, utilizamos a técnica de anisotropia de fluorescência para a reconstituição dos heterodímeros formados entre as subunidades Pac -1 e -3α com a subunidade Pac-1β, bem como reconstituir a interação formada entre Pac-1 e Pac-3α, e posteriormente determinar as constantes destas interações. Para tanto, as proteínas foram tituladas em concentrações crescentes, em uma faixa que permita a obtenção de uma curva de interação a partir da medição de anisotropia. O cálculo da anisotropia foi feito pelo

software do próprio equipamento (Envision PerkinElmer) pela seguinte equação:

,

I

I

G

onde

,

)

2GI

(I

)

I

-

(I

r







onde r = anisotropia; Ivv = intensidade de emissão quando o polarizador da excitação e da emissão estão orientados verticalmente; Ivh = intensidade de emissão quando o polarizador da excitação se encontra na posição vertical e o polarizador da emissão se encontra orientado horizontalmente; Ihh = intensidade de emissão quando o polarizador da excitação e da emissão estão orientados horizontalmente; Ihv = intensidade de emissão quando o polarizador da excitação se encontra na posição horizontal e o polarizador da emissão se encontra orientado verticalmente.

89 Os valores de anisotropia foram normalizados, subtraindo da medida o valor de anisotropia obtido somente para a proteína marcada, desta forma, corrigindo o background. Os valores de Kd foram estimados utilizando-se os valores de anisotropia obtidos, ajustados por regressão não-linear de mínimos quadrados empregando-se o software Origin (OriginLab) utilizando-se a seguinte equação:

𝒚 = 𝒂𝒊 + (𝒂𝒇 − 𝒂𝒊)(

(𝒙_𝒌𝒏_𝒏) 𝟏 + (𝒙_𝒌𝒏_𝒏)

)

Onde y é o valor de anisotropia medido, ai é a anisotropia inicial, af é a anisotropia final, k é a constante de dissociação (Kd), n é o índice de Hill e x é a quantidade de proteína não-marcada adicionada.

Para realizar o ensaio, fizemos a marcação da Pac-1α e Pac-1β purificadas com o fluoróforo FITC (Fluorescein isothiocyanate, Thermo Scientific), seguindo as intruções do fabricante. Após a marcação, as amostras foram purificadas em uma coluna HiTrap Dessalting (GE) acoplada a AKTA FPLC com fluxo de 1 mL/min, para se retirar o excesso de FITC não incorporado. Coletamos alíquotas de 0,5 mL que posteriormente foram quantificadas medindo-se a absorbância em 280 e 494 nm. Para se calcular a concentração da Pac-1α e Pac-1β após marcação empregou-se a seguinte fórmula:

Onde: ε proteína = coeficiente de extinção molar da proteína e fator de correção = A280/A494 = 0.3 (a sonda contribui com absorbância a 280 nm).

90 O ensaio utilizando Pac-1β-FITC foi realizado mantendo-se a concentração fixa em 20 nM e variando a concentração de Pac-1α, através de diluição seriada onde a concentração inicial a 570 µM passou por 17 diluições seriadas na razão constante de volume de 1:1, sobre solução contendo 30 mM de Hepes pH 7,5, 150 mM de NaCl e 0,5 mM TCEP. Em seguida, 67,50 µL de cada diluição foram então acrescentados de 22,50 µL da Pac-1β-FITC diluída na mesma solução e transferidos para uma placa OptiPlate-384 Black (PerkinElmer), com cada poço contendo 25 µL. Foram realizadas leituras periódicas da placa, no período de 0 a 100 horas. Tomou-se a precaução de manter a placa em temperatura ambiente protegida da luz e contra evaporação. Ao total foram realizados três experimentos independentes com três replicatas em cada.

O ensaio da Pac-3α não marcada foi realizado nas mesmas condições descritas acima, no mesmo número de replicações e experimentos. A concentração de estoque inicial foi de 2.700 µM, o qual também passou por 17 diluições seriadas de 1:1 em solução de 30 mM de Hepes pH 7,5, 150 mM de NaCl e TCEP 0,5 mM.

As medidas foram realizadas no equipamento EnVision (PerkinElmer), com excitação do fluoróforo no comprimento de onda de 494 nm e a emissão foi detectada no comprimento de onda de 518 nm, utilizando-se 2 filtros de polarização ortogonais entre si. Os dados coletados foram analisados no software Origin 8.1 (OriginLab).

Para o ensaio de interação com Pac-1α-FITC e Pac-3α não marcada, foi realizado mantendo também a concentração da proteína marcada fixa a 20 nM da proteína marcada e titulando a Pac-3α, por diluição seriada, com concentração inicial a 1300 µM, passando por 17 diluições seriadas na razão constante de volume de 1:1. A adição a proteína marcada, coletada de dados e tempo realização do ensaio foi realizado nas mesmas condições

91 descritas acima, realizando no total dois experimentos independentes com três replicações cada.