Anormalidades nucleares (AN)

Os bulbos de A. cepa, quando expostos às diferentes concentrações do efluente do polimento de rochas ornamentais, apresentaram anormalidades nucleares (AN) em células meristemáticas radiculares (Figura 2 e Tabela 3).

As anormalidades nucleares (AN) podem ser consideradas alterações na morfologia dos núcleos interfásicos após exposição a algum tipo de agente tóxico (LEME; MARIN-MORALES, 2009).

Considerando esta caracterização, as frequências totais de AN, em todas as concentrações do efluente do polimento, foram superiores às encontradas no controle negativo, sendo a maioria delas estatisticamente significativas, com exceção das concentrações 100% e 75% (v/v). A brusca redução das frequências de AN para as maiores concentrações testadas do efluente do polimento pode ter sido em decorrência de outros danos drásticos sofridos pelas células, tais como, a alta frequência de núcleos condensados e o alto grau de degradação dos núcleos nas células meristemáticas da raiz de A. cepa expostas a estas concentrações (Tabela 4 e Figura 3). A análise da frequência total de AN indicou efeito genotóxico dos componentes químicos presentes no efluente do polimento e verificou-se que houve um efeito crescente da toxicidade a partir da concentração 25% (v/v) até a concentração 50% (v/v). Pela análise, apenas da frequência total de AN, não é possível definir os mecanismos de ação destes sobre o material genético da célula, porém analisando isoladamente cada tipo de anormalidade observada, pode-se inferir sobre estes possíveis mecanismos, classificando-os como de ação clastogênica ou aneugênica.

Figura 2 Danos observados nas células das raízes de Allium cepa expostas a diferentes concentrações do efluente do polimento. A-A2- Cromossomos perdidos; B-B2- C- Metáfases; C-C2- Micronúcleos; D- D2- Multipolaridade; E-E2- Pontes cromossômicas, F-F1- Stickiness; F2- Broto nuclear. Barra 50 µm

Tabela 3 Médias da Frequência (%) de AN, MN, brotos nucleares, núcleos lobulados e células binucleadas, núcleos poliplóides e assincrônicos observadas em células meristemáticas radiculares de A. cepa expostas a diferentes concentrações do efluente do polimento de rochas ornamentais e aos testes de controle negativo (água destilada) e positivo (MMS), após 20 dias

Tipos de Anormalidades (%)2 Concentração do efluente do polimento (%) v/v AN (%)1 Brotos MN Núcleos lobulados Célula poliplóide Núcleos assincrônicos Célula binucleada CN 0,02 ± 0,004 e 0 b 0,02 ± 0,004 d 0 b 0 a 0 a 0 a 12,5 0,34 ± 0,025 cd 0,02 ± 0,004 b 0,32± 0,027 bc 0 b 0 a 0 a 0 a 25 0,90 ± 0,043 b 0,54 ± 0,044 a 0,28 ± 0,033 bcd 0 b 0,02 ± 0,004 a 0,04 ± 0,004 a 0,02 ± 0,004 a 37,5 0,94 ± 0,058 bc 0,62 ± 0,054 a 0,32 ± 0,007 b 0 b 0 a 0 a 0 a 50 1,88 ± 0,224 b 1,20 ± 0,200 a 0,34 ± 0,025 bc 0,16 ± 0,027 a 0,02± 0,004 a 0,16 ± 0,032 a 0 a 75 0,18± 0,027 de 0,06 ± 0,008 b 0,12 ± 0,019 cd 0 b 0 a 0 a 0 a 100 0,04 ± 0,004 e 0 b 0,04 ± 0,004 d 0 b 0 a 0 a 0 a CP 2,52 ± 0,081 a 0,76 ± 0.060 a 1,52 ± 0,059 a 0,04 ± 0,004 a 0 a 0,20 ± 0,025 a 0 a

Médias seguidas de erro padrão. As médias seguidas de mesma letra não diferem entre si de acordo com o teste de Kruskal-Wallis a 5% de probabilidade de erro. MN – micronúcleos, AN – anormalidades nucleares (alterações do tipo MN, brotos, núcleo lobado e célula binucleada, núcleos poliplóides e assincrônicos), CN- controle negativo (água destilada) e CP – controle positivo (MMS metil metano sulfonato).

1 _{AN (%) = total de anormalidades nucleares x 100 / total de células avaliadas.} 2 _{(%) = tipo de anormalidade observada x 100 / total de células avaliadas.}

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Os brotos foram as anormalidades nucleares encontradas com maior frequência e observou-se um aumento deste tipo de anormalidade a partir da concentração 12,5% (v/v) até 50% (v/v). Porém, as frequências foram estatisticamente significativas nas concentrações 25; 37,5 e 50% (v/v) em relação ao controle negativo (Tabela 3). Segundo Fernandes, Mazzeo e Marin- Morales (2007), o núcleo ao eliminar material genético forma uma espécie de protrusão gerando os brotos nucleares que posteriormente podem se separar do núcleo dando origem a micronúcleos e microcélulas. Desta forma, a presença de brotos nucleares é uma forte evidência de ação aneugênica dos componentes do efluente do polimento indicando que estes componentes apresentam afinidade e interagem com o fuso mitótico.

O segundo tipo de AN mais encontrado foram os micronúcleos (MN). Esta anormalidade é considerada, por diversos autores, um excelente parâmetro para avaliar efeitos de agentes tóxicos pois permitem análises simples e eficazes (LEME; MARIN-MORALES, 2009).

Os MN se originam de alterações nos cromossomos ou no DNA que as células não conseguem reparar podendo ser repassadas para as futuras gerações celulares, portanto, facilmente fixadas nos organismos. Por estas razões, a presença de MN em células é indicação de mutagenicidade (VENTURA; ANGELIS; MARIN-MORALES, 2008). Segundo Yi e Meng (2003), os MN podem levar a célula à morte devido à supressão de genes essenciais para a proliferação celular.

As frequências de MN observadas nas células meristemáticas de A. cepa foram maiores e estatisticamente significativas às encontradas no controle negativo, para a maioria das concentrações testadas do efluente do polimento, com exceção das concentrações 100, 75 e 25% (v/v) (tabela 3). A drástica redução de MN nas maiores concentrações do efluente, também pode estar

relacionada com o alto comprometimento celular promovido pela incidência de núcleos condensados e degradados neste tratamento.

Anormalidades cromossômicas como cromossomos perdidos ou fragmentados podem dar origem aos MN. Além disso, os brotos nucleares, recurso utilizado pelas células para tentar restaurar a ploidia normal em casos de poliploidização, também podem originar os MN. A figura 2C1, mostra a eliminação de um MN a partir de um broto nuclear, sendo uma forte evidência de que brotos podem ser geradores de MNs.

Segundo Leme e Marin-Morales (2009), a presença de MN além de avaliar os efeitos mutagênicos, permite uma investigação dos mecanismos de ação dos agentes químicos, visto que estas AN podem ser provenientes tanto de fragmentos cromossômicos resultantes de uma quebra (ação clastogênica) quanto de cromossomos inteiros e perdidos (ação aneugênica) durante o processo de divisão celular. Diante disso e pelas frequências estatisticamente significativas de MN nas concentrações testadas: 50; 37,5, e 12, 5 % (v/v) pode- se pressupor que, nas referidas concentrações, o efluente proveniente do polimento de rochas ornamentais apresenta uma ação mutagênica e genotóxica sobre o organismo-teste A. cepa evidenciando um modo de ação tanto aneugênico quanto clastogênico.

Os núcleos lobulados foram observados em células meristemáticas de raízes expostas apenas à concentração 50% (v/v) do efluente do polimento. A frequência encontrada para esta anormalidade foi estisticamente diferente daquela encontrada no controle negativo e semelhante aquela encontrada no controle positivo (Tabela 3). Fernandes, Mazzeo e Marin-Morales (2009) afirmam que núcleos lobulados podem ser originados a partir de anáfases multipolares, uma vez que a presença de multipolaridade parece não impedir que o envoltório nuclear se reestruture. Dessa forma, o envoltório acompanha a distribuição irregular do material genético na célula e origina o núcleo lobulado.

Figura 3 Fotomicrografias de diferentes morfologias, associadas ao processo de morte celular programada em células meristemáticas de pontas de raízes de A. cepa após exposição ao efluente do polimento. (A e A1) Células meristemáticas do tratamento de controle negativo com algumas fases do processo mitótico (setas) e (B), (C), (D) e (E) células meristemáticas após 20 dias de exposição ao efluente do polimento na concentração 100% v/v; (B) Núcleos altamente condensados, fortemente corados e a ausência de divisão celular; (C) Núcleos fragmentados em pequenas esferas formando corpúsculos heterocromáticos no interior do citoplasma; (D) Núcleos com alto grau de degradação; (E) Células com degradação total do núcleo. Barra 50 µm

Outro parâmetro utilizado neste estudo para avaliar os efeitos do efluente do polimento sobre o organismo-teste A. cepa, foi a ocorrência de condensação nuclear.

As células meristemáticas do ápice das raízes de A. cepa após exposição ao efluente do polimento de rochas ornamentais apresentaram núcleos em diversos graus de condensação e degradação da cromatina (Figura 3B, 3C, 3D e 3E).

Para a ocorrência de núcleos condensados (NC), observou-se valores crescentes das frequências a medida que aumentou a concentração do efluente. Com exceção da concentração 12,5% v/v, a frequência de NC diferiram significativamente do controle negativo (água destilada). Comparando-se ao controle positivo (MMS), exceto para as concentrações 12,5 e 25% v/v, em todas as demais a frequência de NC foram muito superiores (Tabela 4).

Tabela 4 Médias da Frequência (%) de núcleos condensados, observados em células meristemáticas radiculares de A. cepa expostas a diferentes concentrações do efluente do polimento de rochas ornamentais e aos testes de controle negativo (água destilada) e positivo (MMS), após 20 dias

Concentração do efluente do polimento (%) v/v Núcleos condensados (%)1

Controle negativo (água destilada) 0 d

12,5 0,32 ± 0,041d 25 12,94 ± 1,083 c 37,5 6,32 ± 0,606 c 50 32,42 ± 1,382 b 75 80,34 ± 2,825 a 100 83,16 ± 2,540 a Controle positivo (MMS) 2,340 ± 0,916 c

Médias seguidas de desvio padrão. As médias seguidas de mesma letra não diferem entre si de acordo com o teste de Kruskal-Wallis a 5% de probabilidade de erro. MMS – metil metano sulfonato.

1 _{NC (%) = total de núcleos condensados x 100 / total de células avaliadas.}

Entre os indicadores de ocorrência de toxicidade está a presença de células com núcleos excessivamente condensados em processo de morte. Em

organismos multicelulares isto pode ocorrer quando as células sofrem danos causados por exposição a agentes tóxicos, desencadeando uma complexa sequência de eventos que podem resultar em morte celular, processo conhecido como morte celular programada (MCP) (GICHNER et al., 2005).

Segundo Behboodi e Samadi (2004), os principais eventos durante o processo de MCP em plantas são as mudanças nas características morfológicas como núcleos condensados e marginais, esferas de cromatina condensada, núcleos fragmentados e corpos apoptóticos semelhantes aos encontrados nas células animais em apoptose.

Embora existam algumas dúvidas sobre a formação de corpos apoptóticos em células vegetais (WANG; BOSTOCK; GILCHRIST, 1996), tem- se observado em plantas a sequência de eventos de MCP como o fluxo de cálcio, liberação mitocondrial de proteínas apoptóticas, ativação de proteases e finalmente a destruição da célula, resultando em morfologia celular do tipo apoptótica observadas em células animais (REAPE; MCCABE, 2010).

As células expostas às concentrações do efluente e observadas nesse estudo apresentaram diferentes graus de destruição celular como: núcleos pequenos e excessivamente corados (Figura 3B), núcleos fragmentados formando corpúsculos heterocromáticos no interior do citoplasma (Figura 3C), núcleos com alto grau de degradação nuclear (Figura 3D) e degradação total do núcleo (Figura 3E).

Neste estudo, observou-se algumas características morfológicas celulares semelhantes àquelas encontradas na apoptose de células animais. Tem sido sugerido que as células vegetais podem degradar os seus núcleos durante o processo de MCP de maneira semelhante à apoptose. Esta degradação nuclear leva ao aparecimento de estruturas semelhantes aos corpos apoptóticos, que por sua vez, são digeridos pelas enzimas presentes nos vacúolos citoplasmáticos (BEHBOODI; SAMADI , 2004; ANDRADE-VIEIRA et al., 2011). Os núcleos

mostrados na Figura 3C indicam um estágio final de morte celular sugerindo grande semelhança com os corpos apoptóticos mencionados nos trabalhos destes autores.

Verificou-se ocorrência de células em processo de morte nas raízes expostas a todas as concentrações testadas. Para as concentrações 100 e 75% (v/v), o percentual de núcleos condensados e degradados ultrapassou 80%. Pode- se perceber que nas concentrações 25 e 37,5% (v/v), a frequência de NC foi semelhante àquela encontrada no controle positivo (MMS) e que a partir da concentração 50% (v/v) esta frequência foi ainda superior àquela encontrada no controle positivo (Tabela 4). Portanto, a indução de condensação nuclear foi um efeito claro e marcante nas células meristemáticas das raízes de A. cepa, provocado pelo efluente do polimento indicando que as células exibem morte programada.

Alterações nucleares como núcleos condensados também foram observados em células meristemáticas de A. Cepa expostas ao SPL e de Lactuca

sativa expostas ao óleo de Jatropha curcas indicando que as células sofreram

morte celular programada (ANDRADE-VIEIRA et al., 2011; ANDRADE- VIEIRA et al., 2014). Liu et al. (2007) também demonstraram a ocorrência de condensação nuclear como um dos marcadores de PCD em células meristemáticas de arroz após estresses osmóticos por sal.

Alterações desse tipo interferem, diretamente, na viabilidade celular, comprometendo, diferentes processos fisiológicos do organismo, portanto, fortemente relacionados à citotoxicidade (KAIOUMOVA; SÜSAL; OPELZ, 2001).

Diante disso, a maioria das concentrações testadas do efluente, induz à MCP do tipo apoptose em células meristemáticas de A. cepa. ratificando o alto potencial de citotoxicidade deste resíduo sobre o organismo-teste.