Aqui são apresentados materiais, métodos e resultados que não foram apresentados nos artigos, mas que acrescentam importantes informações ao trabalho.
Materiais e métodos
1) Morfologia
• Microscopia eletrônica de varredura
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi empregada a fim de se visualizar e analisar a morfologia das nanopartículas. As amostras foram recobertas com ouro utilizando- se o equipamento Sputter Coater POLARON, SC7620, e visualizadas no microscópio LEO Electron Microscopy, Leo 440i, equipado com detector de energia dispersiva de raios-X.
• Microscopia eletrônica de transmissão
Para uma maior ampliação das nanopartículas, a microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi empregada. Foram utilizadas telas de cobre de 200 mesh como suporte. Sobre o suporte foi aplicada uma gota de cada preparação e incubada durante 5 minutos à temperatura ambiente, sendo posteriormente retirado o excesso de solução. Uma gota de acetato de uranila 1% p/v (em solução salina 0,9%) foi, então, adicionada, mantendo a incubação durante 1 minuto à temperatura ambiente, sendo também o excesso eliminado e a tela seca ao ar. As estruturas foram visualizadas em microscópio Carl Zeiss, CEM 902, equipado com filtro de energia Castaing-Henry-Ottensmeyer, sendo as imagens adquiridas através de câmera CCD (Proscan).
• Microscopia de luz polarizada
A microscopia de luz polarizada foi empregada a fim de se diferenciar regiões amorfas e cristalinas. Para isso, utilizou-se o microscópio Jenamed 2, Carl Zeiss – Jena.
2) Rendimento
• Método do carbazol modificado
A análise do rendimento do processo de produção das partículas foi feita determinando-se a concentração de nanopartículas de AH através do método modificado do carbazol, proposto por Bitter e Muir em 1962, o qual quebra as ligações entre as cadeias de AH das partículas e, ao se ligar com os grupos de ácidos urônicos liberados, fornece a concentração da solução. A Figura A.1 apresenta esquematicamente as etapas deste método:
Figura A.1 – Representação esquemática do método modificado do carbazol (Adaptado de Bitter e Muir, 1962)
Inicialmente, volumes de 3 mL da solução 0,025 M de tetraborato de sódio deca- hidratado (Na2B4O7.10H2O) em ácido sulfúrico são colocados em tubos dispostos em uma grade e resfriados a 4 °C. Em seguida, 0,5 mL da amostra com concentração desconhecida é adicionado. A adição ocorre em banho gelado, por ser uma reação muito exotérmica. Os tubos são mantidos fechados com papel alumínio e colocados sob agitação constante, para ocorrer a completa mistura do sistema. Então, cada mistura é colocada em um banho a 100 °C por 10 minutos e, após isso, espera-se o resfriamento da mesma à temperatura ambiente. Então, adiciona-se 0,1 mL da solução de carbazol (0,125% em etanol) com subseqüente agitação. A solução é posteriormente colocada em um banho a 100 °C por 15 minutos e, novamente, espera-se a mesma resfriar a temperatura ambiente. Por fim, faz-se a leitura da amostra no espectrofotômetro à 530 nm. Com os valores obtidos no espectrofotômetro, para as amostras desconhecidas, e a curva de calibração do carbazol obtêm-se os valores das concentrações amostrais.
3) Grau de reticulação • Método do TNBS
A análise do grau de reticualção das partículas foi feita baseada na quantidade de ADH que não reagiu durante o processo. Para isso, utilizou-se o método do TNBS, seguindo o protocolo proposto por Kirker e Prestwich, em 2004. Nesse método, foram adicionados 10 mL de uma solução de TNBS (0,01 M) à amostra previamente liofilizada. A solução foi mantida a 37 °C por 24 horas sob suave agitação. À 1 mL dessa solução foram adicionados 1 mL de glicina (0,03 M) e 5 mL de K2B4O7 (0,1 M), e o sistema foi mantido sob suave agitação, a temperatura ambiente, por 25 minutos. Por fim, 0,1 mL dessa solução final foi adicionado à 0,9 mL de metanol frio, e a absorbância foi medida à 340 nm.
Resultados
1) Morfologia
As imagens obtidas pelas técnicas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET) indicam a formação de nanopartículas esféricas e com tendência à agregação, independente do solvente orgânico utilizado e do processo ter sido feito em modo contínuo ou descontínuo (Figuras A.2 à A.5):
Figura A.2 – Imagens, obtidas pela MEV, das partículas produzidas em modo descontínuo utilizando-se diferentes solventes orgânicos: etanol (A), IPA (B) e acetona (C)
Figura A.3 – Imagens, obtidas pela MET, das partículas produzidas em modo descontínuo utilizando-se os solventes acetona (A) e IPA (B)
Figura A.4 – Imagem, obtida pela MEV, das partículas produzidas em modo contínuo empregando-se o solvente orgânico IPA
Figura A.5 – Imagem, obtida pela MET, das partículas produzidas em modo contínuo empregando-se o solvente orgânico IPA
As microscopias de luz polarizada com melhor resolução foram as das partículas obtidas em acetona (Figura A.6). Observa-se que as partículas formadas nos microcanais (Figura A.6-B) são muito mais esféricas que as obtidas no modo descontínuo (Figura A.6-A). Além disso, nota-se que em ambos os casos existem dois diferentes domínios, mas não é possível distinguir se as partículas obtidas em um processo são mais cristalinas ou amorfas que as outras.
Figura A.6 – Imagens, obtidas pela microscopia de luz polarizada, das partículas produzidas empregando-se o solvente orgânico acetona, em modo descontínuo (A) e contínuo (B)
2) Rendimento
As análises de carbazol foram feitas nos filtrados obtidos após as ultrafiltrações, devido às quantidades significativas de AH que ficavam acumuladas nas membranas de ultrafiltração, mesmo após a sonicação, indicando que o processo de ultrafiltração não foi um bom método de separação das partículas. Dessa forma, o rendimento (Y) do processo de formação das nanopartículas foi calculado pela Equação A.1:
100 * (%) a F a m m m Y = − (Equação A.1) onde a massa total de AH que foi liofilizada (ma) foi calculada através do produto da concentração de AH experimental e o volume de amostra retirada para análise (Equação A.2):
a a
a C V
Exceto para experimentos com etanol, no modo descontínuo, e com acetona, no modo contínuo, os demais rendimentos foram altos, estando acima de 90% (Tabela A.1).
Tabela A.1 – Rendimento dos processos de produção de nanopartículas de AH, nos modos descontínuo e contínuo, com diferentes solventes orgânicos
Processos Solventes Rendimento (%)
Etanol 41,28 ± 3,37 IPA 93,17 ± 0,73 Descontínuo Acetona 90,42 ± 5,85 Etanol 90,00 ± 1,32 IPA 98,99 ± 0,55 Contínuo Acetona 57,16 ± 5,36 3) Grau de reticulação
A maior quantidade de ADH remanescente ocorreu no processo descontínuo com acetona (Tabela A.2). Para o processo descontínuo com IPA ou etanol, e para o processo contínuo com acetona foram obtidas as mesmas absorbâncias e, consequentemente, as mesmas quantidades de ADH remanescente. As menores quantidades obtidas foram com IPA e etanol no processo contínuo. Todavia, como a análise por TNBS é um sistema pouco sensível, como mostrado pela curva padrão (Figura A.7), onde para uma grande variação de massa (de 0 a 8 mg) a absorbância variou apenas de 0,24 a 0,3, só obtivemos uma quantidade remanescente de ADH diferente de zero para o processo descontínuo com acetona.
Tabela A.2 – Grau de reticulação do AH nos processos de produção de nanopartículas de AH, nos modos descontínuo e contínuo, com diferentes solventes orgânicos
Amostra Absorbância Massa de ADH
(mg) ADH livre (%) Acetona - Descontínuo 0,25 0,16 9,32 IPA - Descontínuo 0,24 0,00 0,00 Etanol - Descontínuo 0,24 0,00 0,00 Acetona - Contínuo 0,24 0,00 0,00 IPA - Contínuo 0,05 0,00 0,00 Etanol - Contínuo 0,12 0,00 0,00
Figura A.7 – Curva padrão para a análise de TNBS
De modo geral, observando os valores de absorbância, podemos dizer que no processo contínuo a reticulação é mais eficiente, pelo maior contato da ADH com o AH, já que a ADH já se encontra na corrente do AH, além da ausência de resistência à transferência de massa no processo contínuo. Já no processo descontínuo, a diferença entre as absorbâncias é pequena, variando entre 0,24 e 0,25. Como se coloca o agente reticulante no sistema após duas horas, quando os núcleos de precipitação já foram formados, independentemente do solvente orgânico utilizado, o grau de reticulação é o mesmo, e é maior que nos processos contínuos devido às limitações de transferência de massa existentes em processos descontínuos.