APLICAÇÃO DO EXTRATO BRUTO NA REMOÇÃO DE BIOFILME

A Figura 25 apresenta os resultados de remoção de biofilmes de Pseudomonas sp. previamente formado, adicionando extrato bruto enzimático nas proporções soluto/solvente (NaCl 0,1 mol/L) de 1:2,5, 1:5, 1:7,5 (g/mL) em diferentes tempos de contato (30 min, 60 e 360 min).

Figura 25: Percentual de remoção de biofilme bacteriano (Pseudomonas sp.) após

tratamento com extrato enzimático em função do tempo de contato (30 a 360 min) e razão soluto:solvente de extração (1:2,5 a 1:7,5 m:v). Condições de cultivo: meio composto por 16 g de casca de laranja, 2 g de farelo de trigo e 3,68 g de água de maceração de milho, 65 % de umidade, 5 x 106 esporos/gbu, 96 h. Condições de extração: NaCl (0,1 mol/L), 180 rpm, 30 ºC, 30 min. Letras iguais maiúscula indicam não haver diferença significativa ao nível de 5 % entre diferentes concentrações de extração, hachuras diferentes (Teste de Tukey), letras iguais minúscula indicam não haver diferença significativa ao nível de 5 % (Teste de Tukey), entre as mesmas concentrações de extração, hachuras iguais.

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Avaliando a Figura 25, pode-se constatar que não houve diferença significativa no percentual de remoção de biofilmes em diferentes tempos de contato ao utilizar um extrato com maior concentração de metabólitos, 1:2,5 (m:v), removendo praticamente 70 % do biofilme formado por Pseudomonas sp obtida de tanque de expansão de resfriamento de leite. A remoção de biofilme foi mínima ao manter o extrato enzimático durante 30 min utilizando a concentração de 1:7,5 (m:v), porém, ao aumentar o tempo de contato, nesta mesma concentração, observa-se um aumento na taxa de remoção de biofilme, não diferindo significativamente (p>0,05) das demais concentrações.

Na sequência, foram avaliados diferentes tempos de contato (10, 15, 20 e 120 min) na remoção do biofilme utilizando a concentração de extrato bruto enzimático de 1:2,5 (m:v) e observa-se, na Figura 26, que ao utilizar extrato bruto enzimático mais concentrado, 10 min foram suficientes para remoção de 77 % do biofilme bacteriano.

Figura 26: Percentual de remoção de biofilme bacteriano (Pseudomonas sp.) após

tratamento com extrato enzimático, na concentração de extração de 1:2,5 (m:v), em função do tempo de contato (10 a 120 min). Condições de cultivo: meio composto por 16 g de casca de laranja, 2 g de farelo de trigo e 3,68 g de água de maceração de milho, 65 % de umidade, 5 x 106 esporos/gbu, 96 h. Condições de extração: NaCl (0,1 mol/L), 180 rpm, 30 ºC, 30 min. Letras iguais minúscula indicam não haver diferença significativa ao nível de 5 % (Teste de Tukey).

Ao comparar os valores da Densidade Ótica (DO) das amostras que foram tratadas com extrato enzimático, em diferentes tempos de contato e diluição de extração, com a DO, do controle de esterilidade (sem biofilme e sem extrato enzimático), observou-se que os valores ficaram muito próximos (dados não mostrados), indicando que a remoção do

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biofilme foi praticamente completa, constatando que as condições de cultivo (casca de laranja, farelo de trigo e água de maceração de milho, A. niger ATCC 9642) e de recuperação selecionados, neste estudo, possibilitaram a extração de um extrato bruto enzimático que apresentou potencial para ser empregados em superfície de equipamentos, utilizados em linha de processamento de leite e derivados, como agente anti-incrustante.

Escassas são as informações na literatura sobre a utilização de extratos enzimáticos na remoção de biofilmes microbianos aderidos às superfícies de equipamentos de linha de processamento de alimentos e bebidas. Orgaz et al. (2006) avaliaram a capacidade de remoção de biofilme formado por Pseudomonas fluorescens, utilizando o sobrenadante da fermentação submersa produzido por três cepas de fungos diferentes (A. niger,

Trichoderma viride e Penicillium spp) e obtiveram uma remoção de 84 e 60 % ao

empregar extrato obtido do agente biológico T. viride e A. niger, respectivamente. Ao aplicar o sobrenadante, da fermentação produzida por A. niger, obtiveram uma remoção de 60 % do biofilme após 1 h de contato. Os autores relatam que há possibilidade da remoção do biofilme não seja somente causada pela ação das enzimas testadas (pectina esterase, polygalacturonase, pectina liase, proteinase, cellulase, alginate lyase e arabinase), podendo ser influenciado, também, por outros metabólitos formados durante a bioprodução.

Outro fator, que também pode ser vinculado a esta remoção do biofilme microbiano, poderá estar associado ao sinergismo entre o complexo enzimático formado com distintas atividades. Zanaroli et al. (2011) analisaram a ação de enzimas hidrolíticas comerciais (α- quimotripsina, ficina, α-amilase, celulase e lipase) sobre os componentes das substâncias poliméricas extracelulares (EPS) presentes no biofilme bacteriano, formado por

Pseudoalteromonas e Rhodobacter, e constataram que nenhuma das enzimas estudadas foi

capaz de inibir a formação de biofilme quando aplicado isoladamente. No entanto, uma mistura destas mesmas enzimas apresentou um percentual de redução de 90%, sem afetar crescimento planctônico da mesma comunidade microbiana.

Em função disso, devido à heterogeneidade EPS, uma mistura de enzimas pode ser necessária para eficiente degradação do biofilme. Para tanto, avaliou-se a atividade enzimática da exo-PG, PME, PMGL, FPase, CMCase e Xilanase do extrato enzimático obtido do CES. Conforme mostra a Tabela 16, as enzimas que apresentaram maior atividade hidrolítica foram a PMGL e xilanase, indicando que há possibilidade da ação dessas enzimas seja mais intensa no processo de remoção do biofilme formado por

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Tabela 16: Valores das atividades das enzimas pectinases, celulases e hemicelulases no

extrato bruto enzimático, obtido da diluição 1:2,5 (m:v) e utilizado na remoção de biofilme de Pseudomonas sp.

Enzimas Atividade enzimática (U/mL)

Exo-Poligalacturonase (Exo-PG) 1,93 ± 0,67

Pectina metilesterase (PME) 3,55 ± 0,03

Pexina liase (PMGL) 26,5 ± 5,11

FPase 0,15 ± 0,047

Carboximetilcelulase (CMCase) 0,18 ± 0,001

Xilanase 32,0 ± 0,11

Condição de cultivo: meio composto por 16 g de casca de laranja, 2 g de farelo de trigo e 3,68 g de água de maceração 65 % de umidade, 5 x 106 esporos/gbu. Condição de extração: NaCl (0,1 mol/L), 180 rpm, 30 ºC,

30 min. Condição de reação: tampão acetato de sódio 0,2 mol/L, pH 5,5, 37 ºC, 6 min (exo-PG); NaCl 0,2 mol/L, pH 7,0, 30ºC, 10 min (PME); tampão Tris-HCl 0,05 mol/L, pH 4,5, 55 ºC, 20 min (PMGL), tampão citrato de de sódio 0,05 mol/L, pH 5,3, 50ºC, 60 min (FPase); tampão citrato de de sódio 0,05 mol/L, pH 4,8, 50ºC, 30 min (CMCase); tampão citrato de de sódio 0,05 mol/L, pH 5,3, 50ºC, 5 min (Xilanase).

Na literatura, encontram-se trabalhos sobre a aplicação de enzimas comerciais na remoção e a prevenção de biofilme formado em equipamentos da indústria de alimentos, papel, celulose e placas dentárias (LEQUETTE et al., 2010; CORDEIRO e WERNER, 2011; TORRES et al., 2011; MARCATO-ROMAIN et al., 2012). Lequette et al. (2010) sugerem uma combinação de enzimas, componentes tensoativos, dispersantes e agentes quelantes como a alternativa eficaz de agentes de limpeza de superfícies de equipamentos. Oulahal-Lagsir et al. (2003) utilizaram uma combinação de tratamento ultrasônico e preparação de enzimas para avaliar a eficiência da remoção de biofilme formado por

E. coli em superfície de aço inoxidável. Torres et al. (2011) avaliaram 17 enzimas comerciais na prevenção de biofilmes formados em biorreatores de fluxo contínuo e constataram que a ação da pectina metilesterase, uma enzima encontrada na formulação de duas das misturas testadas, foi identificado como um composto ativo, capaz de reduzir a formação de biofilme em 71% em comparação com ensaios de controle.

Johansen et al. (1997) avaliaram a ação da enzima comercial Pectinex Ultra SP (preparação enzimática de multicomponentes contendo a atividade da protease, pectinase, arabanase, celulase, hemicelulase, b-glucanase, xilanase) sobre os biofilmes formados por

S.aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa e P. fluorescens e constataram uma redução

significativa no número de células bacteriana presente no meio, indicando que a atividade da enzima é devido principalmente pela degradação de polissacarídeos extracelulares, sem qualquer atividade bactericida significativa contra qualquer das quatro estirpes estudadas.

Conclusões e Perspectivas

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