Aplicação dos métodos a amostras reais

De modo a avaliar a aplicação das novas metodologias desenvolvidas a amostras reais, realizaram-se ensaios em diversos tipos de matrizes, nomeadamente água residual, superficial e do mar.

Capítulo 6 Resultados e Discussão

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À semelhança de outros métodos de preparação de amostra vulgarmente usados para análise de traços, a eficiência da extracção da SBSE–LD pode ser afectada pela complexidade da amostra, pelo que foi aplicado o SAM no presente estudo, por forma a minimizar eventuais efeitos de matriz. As amostras foram avaliadas pelos métodos desenvolvidos com quatro níveis de fortificação (10 - 60 µg/L), bem como o respectivo ensaio em branco (ponto zero) sem fortificação. A figura 6.17 ilustra os perfis cromatográficos obtidos de uma mistura padrão (10 µg/L) contendo os seis fármacos acídicos após ensaios realizados por SBSE(PDMS) e SBSE(PU) seguido de LD-HPLC-DAD em água ultra-pura, bem como o respectivo controlo (a) e água superficial fortificada para um nível de concentração 24,0 µg/L (b), sob condições experimentais optimizadas. É possível verificar um bom desempenho analítico quer no processo de extracção quer na aplicação da presente metodologia a amostras reais, bem como excelente selectividade para os analitos alvo.

Figura 6.16 – Perfis cromatográficos obtidos de uma mistura padrão (10 µg/L) contendo os seis

fármacos acídicos após ensaios realizados por SBSE(PDMS) e SBSE(PU) seguido de LD/HPLC-DAD em água ultra-pura, bem como o respectivo controlo (a) e água superficial fortificada para um nível de concentração 24,0 µg/L (b), sob condições experimentais optimizadas36.

b a

Resultados e Discussão Capítulo 6  

127 A tabela 6.14 resume os resultados obtidos por SAM para cada amostra, nomeadamente os coeficientes de correlação (r) e as recuperações médias obtidas para um nível de fortificação igual a 10 µg/L. Por análise de amostras sem fortificação constatou-se que a concentração de cada fármaco acídico estudado era menor que o LOD da presente metodologia. Apesar da nova metodologia ter provado ser apropriada para análise de fármacos acídicos ao nível de traços, o seu desempenho pode ser melhorado com recurso ao sistema de LC-MS, permitindo desta forma alcançar maior selectividade e sensibilidade, com diminuição dos limites de detecção.

Tabela 6.14 – Coeficiente de correlação (r) e % de recuperação obtida para os seis fármacos

acídicos estudados em água residual, superficial e do mar pelo SAM, por SBSE(PDMS) e SBSE(PU) seguida de LD/HPLC-DAD, sob condições experimentais optimizadas.

Matrizes

r % Recuperaçãoa

Residual Superficial Mar Residual Superficial Mar

PDMS NAP 0,9953 0,9962 0,9992 5,02,6 7,44,5 9,10,8 DIC 0,9955 0,9978 0,9999 28,710,3 32,413,3 34,18,6 IBU 0,9952 0,9981 1,0000 31,35,7 34,16,0 39,57,6 MEF 0,9956 0,9977 0,9984 82,46,1 65,16,0 77,77,3 GEM 0,9958 0,9980 0,9988 60,611,6 57,94,7 64,17,3 PU ACA 0,9962 0,9899 0,9995 41,14,9 25,02,8 11,23,6 NAP 0,9964 0,9964 0,9964 70,410,5 45,73,6 63,95,4 DIC 0,9999 0,9966 0,9974 74,010,5 55,27,4 69,32,8 IBU 0,9956 0,9993 0,9964 83,63,7 80,41,1 61,64,3 MEF 0,9966 0,9982 0,9952 75,15,5 54,66,7 67,38,5 GEM 0,9980 0,9978 0,9986 69,84,7 35,87,8 68,84,2 a _{para um nível de fortificação de 10 µg/L}

A aplicação da ANOVA unifactorial permitiu avaliar a influência da matriz na percentagem de recuperação. Uma vez os valores p serem sempre inferiores a 0,05 (anexo G3) significa que existem diferenças estatisticamente significativas entre as recuperações obtidas para as diferentes matrizes, para um nível de confiança de 95 %. Afim de verificar

Capítulo 6 Resultados e Discussão

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quais as matrizes responsáveis por essas diferenças realizou-se um teste de comparações múltiplas – teste de “Tuckey” (anexo G3).

Comparando as percentagens de recuperação obtidas em água ultra-pura relativamente às obtidas para as amostras estudadas, verifica-se que os efeitos de matriz são mais evidentes quando se utiliza o PU. Neste sentido, a ocorrência de efeitos matriz justifica o uso do SAM por estas metodologias desenvolvidas. Esta constatação pode ser suportada com a observação de diversos autores na aplicação de outras técnicas de extracção para análise de fármacos acídicos em matrizes ambientais.35,38

6.6 Acetaminofeno (ACF) e cafeína (CAF)

6.6.1 Considerações gerais

O ACF ou paracetamol é o analgésico e antipirético mais consumido em todo o mundo. Segundo o documento “Estatística do medicamento 2008” elaborado pela Autoridade Nacional do Medicamento e Produtos de Saúde (INFARMED), o ACF é a substância activa com maior número de embalagens no sistema nacional de saúde. Dado o seu elevado consumo, este fármaco também tem surgido como poluente ambiental, podendo ser uma ameaça para diversos organismos terrestres e aquáticos39.

Por outro lado, a CAF é um estimulante presente em alguns medicamentos e em muitos produtos alimentares. É considerada um marcador químico em estudos da qualidade da água, sendo utilizada para a detecção de fontes de poluição de águas residuais domésticas. Esta aplicação, no entanto, ainda é limitada devido à falta de uniformização e validação de métodos analíticos para a respectiva identificação e quantificação neste tipo de matrizes. A CAF tem sido detectada em águas residuais, superficiais e até subterrâneas. As concentrações de CAF em águas residuais não tratadas reflectem não só o seu consumo e excreção, mas também a quantidade proveniente de bebidas e alimentos, nomeadamente, chás e cafés eliminados directamente nos esgotos.

O ACF e a CAF pertencem à lista de compostos analisados pela USEPA em matrizes aquosas, sendo a sua análise contínua ainda um desafio para os químicos analíticos dado a elevada polaridade que apresentam (tabela 6.15).

Resultados e Discussão Capítulo 6  

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Tabela 6.15 – Estrutura química, log KO/W e pKapara o ACF e CAF.

Estrutura química log KO/W

a pKaa ACF 0,46 9,38 CAF -0,07 10,4 a _{Valores de log K} O/W obtidos de [32]

6.6.2 Optimização e validação instrumental

Devido à polaridade e baixa volatilidade dos analitos alvo, a HPLC-DAD foi a técnica instrumental seleccionada, por forma a evitar o passo de derivatização requerido pela GC.

Os parâmetros de HPLC-DAD foram seleccionados de modo a se obterem condições instrumentais apropriadas para a análise simultânea de ACF e CAF. Utilizando uma coluna convencional de fase reversa, uma fase móvel constituída por MeOH e solução aquosa de ácido fosfórico 0,1 % (25/75 %) com fluxo de 1,0 mL/min, obteve-se excelente resposta analítica, com boa resolução para ambos os compostos em tempo analítico aceitável (< 7,0 min). Por análise do espectro UV-vis verificou-se que o comprimento de onda 205 nm fornecia uma resposta adequada para ambos os compostos em estudo (anexo B).

Posteriormente, testou-se a gama linear dinâmica instrumental usando seis soluções padrão, com concentrações compreendidas entre 0,6 e 10,0 mg/L para o ACF e 0,3 a 10,0 mg/L para a CAF. Verificou-se, desta forma, excelente resposta linear, com coeficientes de correlação (r) iguais a 0,9999 para ambos os compostos. A sensibilidade instrumental foi igualmente testada por determinação dos LODs e LOQs em condições de repetibilidade, com recurso à análise de seis ensaios do padrão de concentração mais baixa da gama linear dinâmica. Para o ACF os valores de LODs e LOQs obtidos foram iguais a 120 e 400 µg/L e para a CAF a 89 e 297 µg/L, respectivamente. A precisão instrumental foi ainda avaliada com recurso a injecções consecutivas dos padrões com concentração 1,0, 6,0 e 10,0 mg/L, obtendo-se um RSD inferior a 3,8 %. Por análise de brancos verificou-se a ausência de contaminação, assim como de efeitos de memória.

O H NH O N N N N O O

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6.6.3 Desenvolvimento do método micro-extracção adsortiva em multi-esferas