Atualmente, encontram-se na literatura diversos estudos relacionados ao efeito da PDT quando associado ao tratamento convencional. O grande foco desses estudos é a variação de alguns parâmetros, como o tipo de laser (potência e comprimento de onda), tempo de irradiação, corante, fibra óptica, bactéria, entre outros.
Garcez et al. (2003) em uma revisão bibliográfica, analisaram o emprego do uso do laser de baixa potência associado à diferentes corantes, com concentrações e tempo de irradiação variáveis, com a finalidade de verificar a efetividade antimicrobiana sobre algumas bactérias. Foi visto em Silbert et al. (2000) que o AM a uma concentração de 0,01%, com aplicação do laser He-Ne (633 nm) por 4 min reduziu a concentração bacteriana em 100% para o caso da S.mutans e 40% para E. faecalis. Garcez (2002) verificou in vitro, que utilizando uma pasta de azuleno e o laser de diodo a 685 nm houve uma redução de 100% de E. faecalis. Garcez et al. (2002) em um relato de caso clínico, verificaram que o azuleno, por ser um corante natural, pode ser utilizado em concentrações mais altas, sem que ocorra toxicidade os tecidos normais do paciente. Os autores concluíram que a PDT é um eficiente método de redução bacteriana. Seu uso na odontologia é bastante indicado devido sua eficiência em infecções de pouca profundidade, ao seu baixo custo, ausência de efeitos sistêmicos e por não fornecer risco de provocar resistência bacteriana.
Em outra revisão de literatura, Lee et al. (2004) avaliaram a PDT que suas aplicações clínicas incluem as desinfecções de cáries profundas, bolsas periodontais, sítios perimplantes e feridas da mucosa. O tratamento com o uso da PDT não apresenta nenhum efeito térmico prejudicial, não causando nenhum ferimento sejam eles térmicos ou químicos. A eficácia do tratamento é maior quando se utiliza um difusor de luz intracanal flexível, que pode alcançar cerca de 4 mm do ápice. A PDT é muito eficiente tanto sobre bactérias positivas quanto Gram-negativas, sendo que estas ultimas possuem moléculas de porfirinas que servem como FS endógenos. Concluiu-se que esta técnica é muito eficiente e que pode ser usada para a erradicação de infecções endodônticas persistentes, quando os métodos convencionais não obtiveram sucesso.
Soukos et al. (2006) investigaram in vitro o efeito do laser de diodo (Ga-Al-Al – 660 nm), associado ao AM (25 µg/mL) sobre duas bactérias Gram-positivas (P.
micros e E. faecalis) e quatro espécies Gram-negativas (F. nucleatum ,P. intermédia, P. gengivalis e P. endodontalis). Dois tipos de experimentos foram realizados utilizando o mesmo laser de diodo:
G1- foi realizado utilizando suspensão de bactérias em uma placa de 24 poços. A solução foi incubada com o FS por 5 min e depois exposta pelo laser por 5 min (fluência da energia de 30 J/cm2 e irradiância de 100 mW/cm2). As frações que sobreviveram foram contadas pelas UFC em placas de ágar. G2- foi realizado utilizando 60 dentes unirradiculares, recém extraídos, armazenados em NaOCl 0,5% por 2 a 8 semanas, tratados convencionalmente e infectados com E. faecalis. Após o crescimento dos microorganismos, esses dentes foram sensibilizados com AM (25 µg/mL) por 5 min, em seguida expostos a um laser utilizando uma fibra que distribui a luz uniformemente a 360° por 5 min (fluência da energia de 222 J/cm2 e irradiância de 740 mW/cm2).
Os resultados alcançados por G1 são apresentados na tabela 4, onde verifica-se que o AM combinado com a luz vermelha eliminou completamente todas as espécies bacterianas, com exceção da E. faecalis (53%). No experimento G2, quando utilizado somente AM, observou-se uma redução de 83,2% do biofilme de E. faecalis. Quando utilizado somente a luz, a redução foi de 56,6% e quando aplicado o AM com a luz, obteve-se uma redução de 97% de E. faecalis.
Tabela 4 - Taxa de sobrevivência (%) dos microorganismos apos a incubação com somente azul de metileno ou azul de metileno com irradiação de luz vermelha.
Espécies Somente Azul de metileno TFD
P.micros 21 ± 10.6 0 E.faecalis 94.5 ± 17.6 47 ± 12.1 F.nuc.nuc 5.5 ± 0.4 0 P.intermedia 0 0 P.gingivalis 6.7 ± 0.1 0 P.endodontalis 0 0
A incompleta esterilidade do canal radicular pela PDT não pode ser atribuída à falha de infiltração da luz ou do AM nos túbulos dentinários, pois há uma forte evidencia de que a luz se propaga na dentina. Assim, uma possível explicação é que a alta irradiância (740 mW/cm2) usada pode ter causado um rápido consumo do oxigênio molecular. Assim, a PDT pode ser utilizada como um tratamento coadjuvante para eliminar bactérias do canal radicular.
Garcez et al. (2006), realizaram um estudo com o propósito de avaliar a redução de E. faecalis seguido da PDT com pasta de azuleno ou desinfecção com NaOCl 0,5%. Uma pasta de azuleno (solução a 25%) foi utilizada. Esta pasta era composta por 10% de peróxido de uréia, 15% de detergente e 75% de carbowax (polietilenoglicol), resultando em uma concentração final de 0,01%. E. faecalis foi subcultivado em BHI (Brain Heart Infusion). Tubos de ensaio com 0,5 mL de BHI foram contaminados por 0,5 mL de E. faecalis em suspensão salina e foram incubados a 37°C por 24h. Foram feitos 2 tipos de experimentos, sendo que no primeiro experimento foram feitas 5 pesquisas, usando 3 tubos de ensaio em cada grupo:
G1: E. faecalis sem laser e sem pasta; G2: E. faecalis + laser e sem pasta;
G3: E. faecalis foi incubado com a pasta por 5 min sem o laser; G4: E. faecalis + pasta por 5 min + laser;
G5: (NaOCl): E. faecalis + 0,5 % NaOCl por 8 min;
As irradiações foram feitas de baixo para cima por 180 s, usando o laser de diodo 685 nm, com potência 50 mW e energia 9 J.
No segundo experimento foram utilizados 30 dentes (incisivos centrais superiores e caninos superiores), as coroas foram removidas e então as raízes foram encurtadas a 13 mm. Os canais receberam o tratamento convencional antes da inoculação. Os dentes foram autoclavados por 15 min a 121°C. Depois, os canais foram preenchidos com 10 µL de suspensão bacteriana. Após 24h, os dentes foram separados randomicamente em 3 grupos de 10 dentes cada e amostras iniciais foram coletadas de todos os dentes usando ponta de papéis estéreis mantidos dentro dos canais por 1 min para confirmar a contaminação e para obter o número inicial de microorganismos viáveis.
Grupo NaOCl: NaOCl 0,5% por 30 min; Grupo PDT: Pasta por 5 min + laser;
Grupo controle: preenchidos com solução de BHI e incubados por 24h.
A luz foi distribuída através de uma fibra óptica de 365 µm, que foi colocada na porção apical da raiz do canal e movimentos helicoidais do ápice para cervical foram realizados manualmente para melhor a difusão da luz vermelha dentro da luz do canal. A potência de saída do laser com a fibra óptica foi de 10 mW, a energia
entregue foi de 1,8 J e o tempo de exposição não foi alterado. Após os tratamentos, os dentes foram lavados com solução salina e pontos papéis estéreis foram utilizados para determinar as UFC (Unidades Formadoras de Colônias). De acordo com o experimento 1, o laser e a pasta não obtiveram efeitos notáveis quando utilizados separadamente sobre E. faecalis, porém os tratamentos com a PDT e com NaOCl 0,5% alcançaram significativa redução da viabilidade das células (99,9% e 97,1%, respectivamente). Para o experimento 2, os resultados mostraram o crescimento no grupo controle após 24h. Maior redução de E. faecalis foi alcançada com o PDT (99,2%) enquanto que o uso de NaOCl 0,5% por 30 min resultou em uma redução de 93,3%. Neste estudo, conclui-se que a PDT foi mais eficiente que de NaOCl 0,5% para reduzir as bactérias dentro dos canais. Os resultados sugerem que o uso de PDT como um tratamento coadjuvante ao tratamento convencional endodôntico pode levar a redução de patógenos em um curto período de tempo porém, outros estudos devem ser feitos para determinar exatamente o escopo do PDT nas infecções orais.
Foschi et al. (2007) estudaram in vitro o efeito da PDT utilizando o FS AM. Para tanto, 64 dentes foram infectados com E. faecalis, sendo que após 3 dias 4 amostras foram utilizadas para fazer a microscopia eletrônica de varredura (MEV) para confirmar o estabelecimento da infecção. Após a confirmação, as 60 amostras restantes foram divididas em 4 grupos de 15, sendo:
G1: sem luz e sem AM (grupo controle); G2: AM somente;
G3: somente luz; G4: Luz + AM.
O AM foi utilizado em uma concentração de 6,25 µg/mL por 5 min e, em seguida, exposto a um laser de diodo com um comprimento de onda de 665 nm por 10 min (fluência de energia 60 J/cm2 e irradiância de 100 mW/cm2). Para entregar a luz nos canais radiculares, foi acoplado uma fibra óptica flexível com difusores cilíndricos de 500 µm, que distribui a luz uniformemente a 360°. O conteúdo de bactérias sobreviventes dos canais radiculares foram calculados pela contagem de UFC. A PDT alcançou 77,5% de redução de E. faecalis, o AM (grupo G2) e a luz (grupo G3), reduziram a viabilidade bacteriana de 19,5% e 40,5%, respectivamente.
A luz vermelha sozinha não está apta a erradicar os microorganismos, mostrando que o AM possui um papel fundamental no tratamento, pois se infiltra nos túbulos dentinários e a luz consegue se propagar na dentina, sendo espalhada pelos túbulos dentinários. A inabilidade de eliminar totalmente os microorganismos pode ser devida á complexidade da entrega da luz e da dosimetria. Os resultados obtidos neste estudo apenas reforçam a necessidade de determinar a concentração ótima de AM e parâmetros para maximizar a potência do laser, já que os canais radiculares não são infectados apenas por E. faecalis.
Begman et al. (2007) realizaram um estudo para analisar o efeito bactericida da PDT sobre S. anginosus, E. faecalis ou F. nucleatum, inoculados em canais radiculares. O estudo iniciou-se com um tratamento convencional em 38 dentes premolares inferiores, os quais foram randomicamente divididos em 4 grupos, sendo um deles o grupo controle negativo:
G1:12 dentes inoculados com S. anginosus; G2: 12 dentes inoculados com E. faecalis; G3: 12 dentes inoculados com F. nucleatum; G4: 2 dentes para controle negativo.
Para cada grupo foi realizado 4 tipos diferentes de tratamento: A: PDT (corante + laser);
B: Laser de controles (fluido de transporte reduzido + laser); C: Controle corante (corante + sem laser);
D: Controle positivo (fluido de transporte reduzido).
Com a finalidade de reduzir os efeitos da anatomia de cada canal, todos os dentes foram reutilizados 3 vezes e para realizar o controle das vezes utilizadas foi criado um código, de acordo com a figura 1. Neste experimento foi utilizado um laser de diodo com 100 mW de potência, 635 nm e com energia de 15 J. A luz foi transferida por uma ponta fina e flexível de 300 µm, o corante utilizado foi o AT (12,7 mg/mL) por 1 min sob agitação e o tempo de ativação foi de 150 s.
Ao fim do tratamento, os líquidos no interior do canal foram absorvidos e analisados pela contagem de UFC. Após 2 dias de incubação, observou-se que todos os grupos controles apresentavam bactérias. Nos dentes tratados com o
procedimento A ocorreu uma redução significativa da carga bacteriana a uma percentagem de 93,8% para S. anginosus, 88,4% para E. faecalis e 98,5% para F. nucleatum. Já os tratamento B e C não tiveram nenhum efeito significativo sobre a carga bacteriana. As três cepas utilizadas neste estudo são conhecidas como espécies predominantes em qualquer infecção primária, porém os resultados mostraram que E. faecalis tem um crescimento mais rápido quando comparado com outras espécies. Assim, a combinação do laser com um corante adequado, se torna obrigatória para se obter a desinfecção. Conclui-se então, que a PDT não é uma alternativa, mas um complemento possível para protocolos já existentes, podendo esta ser otimizada com mais pesquisas sobre a interação entre a PDT, especificidade microbiana e o rompimento do biofilme.
Figura 1 - Diagrama do progresso da amostra através do estudo de corte transversal projetada.
Outro estudo realizado in vitro, foi o de Garcez et al. (2007), que compararam os efeitos da terapia endodôntica convencional da PDT e da combinação entre as duas técnicas. Foram utilizados 10 dentes extraídos de humanos, infectados por 3 dias para formação de biofilme. As bactérias utilizadas eram Gram-negativas
bioluminescentes, (P. micrabilis e P. aeruginosa). Esses dentes foram divididos em 3 grupos:
G1: Infectados com P. micrabilis; G2: Infectados com P. aeruginosa; G3: Grupo controle.
Nos períodos de 1, 2, 3 e 4 minutos uma câmera especial gravou uma imagem dos níveis de bioluminescência após cada minuto de iluminação (2,4 J/min) (Fig. 2). Nos grupos 1 e 2 foram feitos 3 tipos de tratamento: tratamento convencional, somente PDT e a combinação dos dois tratamentos. No tratamento com PDT os canais foram preenchidos com uma combinação de FS, polietilnoimina (PEI) e clorin (ce6) por 10 min, juntamente com o laser de diodo (Ga-Al-As), emitindo a 40 mW, com comprimento de onda de 660 nm, acoplado com uma fibra de 200 µm.
Os resultados do tratamento convencional mostraram uma diminuição de 90% das bactérias luminescentes. A PDT apresentou uma diminuição de 95% e a combinação de ambos os tratamentos apresentou diminuição de 99%. Dessa forma, observa-se que todos os tratamentos foram efetivos na redução das bactérias bioluminescentes, sendo que a PDT foi mais eficiente do que o tratamento endodôntico, embora os níveis de recontaminação após 24h não mostraram diferença significativa entre os tratamentos. Já a combinação dos dois foi muito mais efetiva. Assim, os resultados sugerem que a PDT é um coadjuvante ao tratamento endodôntico convencional.
Figura 2. Imagens da bioluminescência capturada dos dentes infectados com P. aeruginosa por 3 dias. Os dentes receberam em: (A) antes, (B) depois de 24 hdo tratamento endodôntico convencional; (C) antes, (D) depois, (E) depois de 24 hda PDT; (F) antes, (G) depois da incubação com os fotosensibilizantes, (H) depois da iluminação, (I) 24 h depois do tratamento convencional suido pela PDT; (J) antes, (K) depois do tratamento endodôntico convencional, (L) depois da PDT, (M) após 24 h.
Fimple et al. (2008) investigaram in vitro o efeito fotodinâmico do AM em várias espécies de biofilmes compostos por, A. israelli, F. nucleatum, P. gingivalis e P. intermedia. Uma solução contendo as bactérias especificadas foi inserida dentro de 120 dentes tratados. Esses dentes foram incubados anaerobicamente por 3 dias, para o crescimento do biofilme. As 4 espécies de microorganismos foram detectadas nos canais utilizando sondas de DNA. As análises de MEV mostraram a presença do biofilme nos dentes antes de serem tratados. Os dentes infectados foram divididos em 2 grupos de experimentos A (AM dissolvido em BHI) e B (AM dissolvido em fosfato de sódio salino), como mostra a tabela 5.
Tabela 5 - Descrição do tratamento realizado nos grupos especificados. Grupos Luz Corante Quantidade de dentes
A1 (controle) Ausente ausente 19
A2 Ausente presente 18
A3 Presente ausente 17
A4 Presente presente 18
B1 (controle) Ausente ausente 13
B2 Ausente presente 13
Os dentes foram incubados com AM (25 µg/ml) por 10 min seguido pela exposição de uma fonte de irradiação de laser de diodo de 665 nm, com fluência de 30 J/cm2 e potência de 1 W. O sistema foi acoplado com uma fibra óptica capaz de distribuir a luz em 360°. A luz foi então aplicada no sistema de canais durante 2,5 min, seguido de uma pausa de 2,5 min e uma segunda exposição de 2,5 min. No grupo de experimentos A, a combinação da luz com o AM forneceu a menor contagem de colônias, ou seja, o melhor resultado. O mesmo foi visto para o grupo B. Quando comparamos os resultados do grupo A4 e B3, percebe-se uma redução de 73% e 80% das colônias, respectivamente. O AM sozinho reduziu em 25% o numero de colônias do grupo A2 e 34% do grupo B2. Já a luz sozinha não apresentou nenhum efeito na viabilidade bacteriana (Fig. 3). Essas diferenças ocorridas podem ser devido à presença de proteínas séricas que estão presentes no DNA, na solução de BHI. Assim, pode-se concluir que a irradiação do laser associado ao uso do corante AM foi mais eficaz, tanto com BHI como com fosfato de sódio salino.
Figura 3 - Fototoxicidade das multi espécies do canal radicular apos a incubação com AM dissolvido em BHI (A) e PBS (B). Cada barra é a media logarítmica dos níveis de CFU.
Objetivando analisar in vitro o efeito da PDT sobre colônias bacterianas, Fonseca et al. (2008) utilizaram 46 dentes humanos, divididos em 2 grupos, um grupo controle que não recebeu o tratamento com PDT e um outro grupo de teste. Todos os dentes foram esterilizados e, em seguida, foi aplicado uma solução de E. faecalis em BHI. Os dentes foram incubados a 35°C, por 48 h. Os canais do grupo
A1 A2 A3 A4
B
1
de teste foram preenchidos com uma solução aquosa de 0,0125% de AT por 5 min e submetidos ao laser de diodo (Ga-AL-As), a 660 nm, acoplado com uma fibra óptica de 600 µm, por 320 s. A potência utilizada foi de 50 mW e a fluência de energia entregue 6,4 J. Os dentes do grupo controle não receberam nenhum tratamento de PDT e foram incubados por mais 48h. Os resultados mostraram que ocorreu uma diminuição de 99,9% de bactérias no grupo de teste e um aumento de bactérias de 2,6% no grupo controle. Os autores concluíram que o PDT é viável como agente bactericida em um modelo de dente contaminado com E. faecalis, porém ele não elimina totalmente a contaminação das bactérias.
Garcez et al. (2008) investigaram in vivo o efeito da PDT em pacientes portadores de dentes com necrose pulpar e lesão periapical. Para tal, foi realizada avaliação microbiológica em 20 canais de dentes anteriores (incisivos e caninos). As amostras foram coletadas com 3 pontas de papel absorvente esterilizadas. As coleta foram realizadas antes e após o tratamento convencional e outra após o uso da PDT. O FS conjugado de PEI e ce6 (60 µM) foi depositado dentro do canal por 2 min, o laser de diodo (Ga-Al-As), acoplado com uma fibra de 300 µm foi utilizado a 660 nm, com uma potência com total de 40 mW, 9,6 J de energia por 240 s. O laser foi aplicado com movimentos em espiral, de apical para cervical, para assegurar uma difusão igual de luz no interior do canal. Em seguida, o dente foi selado com material restaurador temporário e o mesmo procedimento descrito anteriormente foi realizado após uma semana. Os resultados foram analisados e foi possível observar que após o primeiro tratamento convencional ocorreu uma redução de 91% das bactérias, após o tratamento convencional + PDT ocorreu uma diminuição de 98,5%. No segundo tratamento convencional ocorreu uma diminuição de 92% das bactérias e após o tratamento convencional + PDT ocorreu uma redução de cerca de 99,9% das bactérias existentes. Assim, os autores concluíram que o PDT é um auxiliar no tratamento convencional, oferecendo uma forma atóxica e eficiente de destruição de microrganismos remanescentes.
Nagayoshi et al. (2011) investigaram os efeitos antimicrobianos da irradiação do laser de diodo sobre E. faecalis em lesões periapicais, utilizando um modelo in vitro de lesão apical. A fonte de irradiação utilizada foi um laser de diodo com
comprimento de onda 805 nm, potência de 5 W acoplado a uma fibra óptica de 400 µm, alcançando um total de energia de 76 J. O modelo in vitro utilizado para simular o defeito de lesão periapical, foi construído com blocos de resinas simulando um canal unirradicular. Uma solução de E. faecalis foi misturada com solução salina, NaOCl a 2,5% ou FS (indocianina verde) com uma concentração de 12,5 mg/mL , inserida no defeito e irradiada com laser de diodo por 30, 60 ou 120 s. Outra análise realizada neste estudo, foi o efeito do calor produzido pela irradiação na viabilidade da espécie E. faecalis. Após a irradiação com FS por 30 s, a viabilidade de E. faecalis diminui 72%, e após 60 s ou mais não foi detectada nenhuma viabilidade celular. A irrigação com solução salina não apresentou nenhum efeito antimicrobiano, enquanto que a utilização de uma solução de NaOCl a 2,5% eliminou completamente as bactérias. Quando utilizado o laser sem o FS por 120 s, ocorreu uma diminuição da viabilidade de apenas 25%. A aplicação do laser por 60 s aumentou a temperatura da área lesionada para 65°C , entretanto foi visto que essa temperatura não teve nenhum efeito na viabilidade bacteriana, indicando que a redução de E. faecalis foi somente devido a irradiação do laser. Concluindo, a irradiação com laser de diodo em combinação com o FS tem efeito antimicrobiano semelhante a NaOCl 2,5% e pode ser útil nos tratamentos clínicos de lesões periapicais.
Raymond et al. (2011) realizaram um estudo sobre o efeito antimicrobiano da PDT em dentes humanos infectados ex vivo. Para realização deste experimento foram utilizados 52 dentes recém-extraídos com necrose pulpar e radioluminescência perirradiculares. Esses dentes foram separados em 2 grupos:
G1: 26 dentes, contendo 49 canais preparados com NaOCl 6%;
G2: 26 dentes, contendo 52 canais preparados com NaOCl 6% + PDT.
Para o G2, os sistemas radiculares foram incubados com AM a uma concentração de 50 µg/mL durante 5 min, exposição de um laser de diodo com uma potência de 1 W , com comprimento de onda de 665 nm, acoplado a uma fibra ótica de 250 µm e com fluência de energia de 30 J/cm2. A luz foi então aplicada no sistema de canais durante 2,5 min, seguido de uma pausa de 2,5 min e uma segunda exposição de 2,5 min. A fibra foi capaz de distribuir uniformemente a luz 360° no interior do canal radicular.
Os conteúdos dos canais radiculares foram quantificados através de lavagem dos canais e foram diluídos em série seguido pelo cultivo em placa em ágar-sangue. As frações que sobreviveram foram calculados pela contagem de UFC. De acordo com os resultados obtidos, o preparo químico + PDT demonstrou melhor performance que apenas o preparo químico. Os canais do G2 apresentaram 86,5% dos canais sem crescimento de colônias, já os canais do G1, apresentaram apenas 49%. Os níveis de detecção pós-tratamento para todos as espécies foram menores para os canais tratados com NaOCl 6% + PDT. As espécies bacterianas dentro dos tubúlos dentinários foram detectadas em 77,3% dos canais tratados com NaOCl 6% e 51,7% dos canais tratados com NaOCl 6% + PDT. Estes resultados indicam que a PDT reduz significativamente as bactérias residuais nos sistemas radiculares e que a PDT, quando aprimorada, é uma promessa substancial como adjuvante para CMD.
Meire et al. (2012) compararam a eficácia de dois lasers de alta potência (Er:YAG e Nd:YAG), duas terapias fotodinâmicas antimicrobianas comerciais (Denfotex e Helbo) e o NaOCl. Esses experimentos foram realizados em biofilmes