Aplicações das membranas de afinidade

As aplicações das membranas de afinidade acompanham de perto os precedentes estabelecidos pela cromatografia por afinidade em colunas. Apesar de tudo, não convém esquecer que a finalidade das membranas de afinidade é aumentar as taxas de fluxo a baixas pressões e reduzir o tempo de processamento. Assim inicialmente, estas membranas não foram desenvolvidas para fornecer processos de separação completamente novos, em vez disso, a sua intenção era acelerar o processo de separação de muitos procedimentos já conhecidos.

Como já foi referido, esta técnica possui uma ampla gama de aplicações, cujo campo de intervenção inclui áreas como a biotecnologia, indústria biofarmacêutica, bioengenharia, aplicações clínicas, investigação científica, imunoterapia, entre outras. Na Tabela 4, podem-se observar vários exemplos de aplicações, bem como o tipo de ligando e material utilizados para a preparação destas membranas. A integridade desta tabela é apresentada no Anexo A-I.

Dos exemplos acima apresentados e relativamente aos ligandos utilizados, sobressaem os corantes, especialmente o F3GA, sendo utilizado em 99% dos casos. No que diz respeito às matrizes é de interesse destacar as que utilizam membranas de celulose, celulose modificada ou membranas compósitas de celulose e outro material.

Vários estudos já foram realizados utilizando acetato de celulose, celulose regenerada, entre outras; um dos principais e mais recentes interesses da CB é a sua utilização como membrana de afinidade. [16,17] Ma e colaboradores [16] funcionalizaram a superfície duma membrana de celulose regenerada com o ligando de afinidade F3GA. As modificações químicas da superfície foram analisadas por espectro ATR- FTIR. Os resultados deste estudo revelaram que as membranas de celulose regenerada continham 130 µmol de corante por grama de celulose e uma capacidade de captura de BSA e bilirubina (resíduo metabólico existente no sangue humano) de 13 mg/g e 4mg/g, respetivamente.

O isolamento de uma proteína ou grupo de proteínas a partir de fluidos corporais para fins terapêuticos, requer um nível elevado de purificação. Existem muitos artigos sobre a purificação de frações de globulinas e vários fatores de coagulação utilizando membranas de afinidade.

Uma outra aplicação interessante destas membranas, para fins terapêuticos, foi relatada por Hou and Zaniewski [28], que purificaram uroquinase a partir de urina humana através de um processo de múltiplos passos. A uroquinase é produzida pelo rim e excretada na urina e quando recuperada e purificada na sua forma ativa, é um agente trombolítico eficaz que catalisa a conversão do plasminogénio em plasmina. A plasmina consegue lisar os coágulos de fibrina, muitas vezes associados com os bloqueios vasculares.

Conforme o número de passos de processamento requeridos aumenta, torna-se progressivamente mais benéfico usar procedimentos de alto rendimento, tais como os oferecidos pelas membranas de afinidade. As taxas de fluxo elevadas obtidas implicam menores tempos de residência na matriz e isto, frequentemente traduz-se, numa maior retenção da atividade biológica do produto, muito importante quando se separam moléculas com propriedades terapêuticas.

Um exemplo mais tradicional de uma aplicação destas membranas é o caso relatado no trabalho de Lutkemeyer e colaboradores [29]. Neste artigo, os autores ligaram covalentemente heparina Startobind modificada (ligando), através da abertura do anel epoxy com diamina. Esta reação é extremamente lenta, demorando oito dias, mas aparentemente conduz a ligações de heparina muito estáveis.

Em vez de imobilizar heparina para capturar determinadas proteínas, Ma e colaboradores [30] modificaram uma série de diferentes tipos de fibras ocas com poli (L-lisina) com o intuito de capturar heparina do sangue. A heparina é um polissacarídeo altamente sulfatado com aproximadamente 20 kDa de massa molecular. Neste artigo, os autores estudaram três diferentes tipos de fibras; a primeira consistia numa fibra de polietileno microporosa revestida com poli (etileno – co – vinil álcool), a segunda era constituída por acetato de celulose e por último, a terceira era uma fibra diálise de celulose pura. Em todos os casos, a poli (L-lisina) foi ligada à matriz após a ativação dos grupos hidroxilo das fibras com BrCN. Os resultados mostraram que a heparina consegue difundir-se em ambas as fibras de polietileno modificadas e nas fibras de acetato celulose. No entanto, é demasiado grande para penetrar na estrutura celulósica das fibras de diálise, por isso neste caso a heparina está limitada à adsorção na superfície. Aproximadamente 15 mg de heparina por metro quadrado de área superficial foi ligada para o caso das fibras que podem ser penetradas, enquanto apenas 5 mg por metro quadrado se ligou na estrutura celulósica.

Champluvier and Kula (1992) [31] relataram a purificação de glucose – 6 – fosfato desidrogenase a partir de um homegenato de levedura - Saccharomyces cerevisiae - através da adsorção numa membrana modificada por F3GA, como passo final de purificação. O tempo de residência mínimo para a ligação da enzima foi estimado em 0,25 segundos e o tempo de processamento foi de 10 minutos, a uma taxa de

fluxo elevada. No mesmo ano, Briefs and Kula, relataram a adsorção dinâmica da proteína BSA em membranas de nylon modificadas com F3GA. [24]

Castilho e os seus colaboradores, em 2000 [2], descreveram a utilização de membranas de nylon revestidas com dextranos e PVA, para produzir matrizes de afinidade com características de funcionalidade química adequada e reduzida ligação não específica de proteínas; esta última característica salientou-se nas membranas modificadas com PVA. Posteriormente procederam à imobilização da proteína A nas matrizes, com a intenção de capturar IgG (imunoglobulina humana G). [8] Xia e colaboradores em 2003, modificaram membranas de nylon através da incorporação de quitosano, de modo a melhorar a hidrofilicidade das matrizes para assim reduzir as interações não específicas na superfície destas. Após este passo, os autores funcionalizaram a superfície das matrizes através da ligação covalente do F3GA, com o intuito final de capturar bilirubina. [11]

Como referido anteriormente inúmeras vezes, a CB é um material muito promissor na área das membranas de afinidade, pois possui propriedades únicas, das quais se destacam uma elevada área superficial, o que facilita e amplifica o acoplamento de ligandos de afinidade na sua superfície. O seu imenso potencial neste campo estende-se a infindáveis aplicações em diferentes áreas.