Aplicações do genoma mitocondrial

O estudo do genoma mitocondrial tem aplicação em três principais áreas: a genética médica, através da análise de mutações que se traduzem em doenças, uma vez que um elevado número de doenças hereditárias são causadas por mutações em genes da região codificante da molécula de ADNmt; a genética populacional (ou antropologia molecular), através do estudo das diferenças e das similaridades entre as populações humanas; e a genética forense, pela obtenção de haplótipos de ADNmt e verificação da coincidência entre duas ou mais amostras biológicas.

Os primeiros estudos realizados na molécula de ADNmt humano tinham por base o uso de técnicas de restrição enzimática - Restriction fragment length polymorphism (RFLPs) – com a utilização de enzimas de restrição na totalidade do genoma mitocondrial (Brown 2006). O avanço tecnológico de métodos de amplificação - Polymerase Chain Reaction (PCR) - e sequenciação - sequenciação de Sanger (Sanger & Nicklen 1977) - de ADN permitiram o estudo mais detalhado da molécula de ADNmt. Neste sentido, começou-se por sequenciar o segmento HVI da região controlo de ADNmt, entre as posições 16 024 e 16 365 (Castrì et al. 2009; Nagai et al. 2003). Mais tarde, estudos incluíram a sequenciação dos segmentos HVI e HVII da região controlo do ADNmt, entre as posições 16 024 e 340 (Afonso Costa et al. 2010; Alvarez et al. 2007; Lima et al. 2006; Coelho et al. 2009; Pereira et al. 2000; Plaza et al. 2004; Gonçalves et al. 2003; Beleza et al. 2005). Nos últimos anos, com o desenvolvimento de tecnologias de sequenciação de alto rendimento, tornou-se comum o estudo da região controlo total do ADNmt (incluindo os segmentos HVI, HVII e HVIII) (Castro de Guerra et al. 2012; Scheible et al. 2011; Mairal et al. 2013) e da totalidade do genoma mitocondrial (Gonder et al. 2006; Knapp et al. 2012).

a. ADNmt e genética populacional

Os estudos de genética populacional permitem determinar a composição genética de uma população. Esta área debruça-se nas diferenças e similaridades genéticas que podem ser detetadas dentro de uma população ou entre populações (Hartl & Clark 1997; Relethford 2012).

O genoma mitocondrial humano tem sido utilizado em estudos de evolução humana para estimar a origem geográfica e a dinâmica das populações. É possível, através destes estudos, obter informação sobre eventos históricos da humanidade.

Os estudos da transmissão materna do ADNmt permitem complementar informações referentes à origem do Homem moderno em África e a sua dispersão pelo mundo (Pinheiro 2010; Rosa & Brehem 2011; Howell et al. 1996).

O primeiro estudo de genética populacional com recurso ao ADNmt foi realizado nos anos 80 através de técnicas de RFLPs (Brown 1980).

Os haplótipos de ADNmt inseridos num determinado haplogrupo apresentam polimorfismos específicos como consequência da partilha de um ancestral comum. Neste

22 sentido os haplogrupos de ADNmt podem estar associados a determinadas regiões geográficas e, em alguns casos, a grupos étnicos particulares.

As sequências de ADNmt de cada indivíduo são utilizadas para construir árvores filogenéticas (Howell et al. 1996). Em 2007, foi desenvolvida na base de dados MITOMAP, a primeira árvore filogenética a partir de sequências de ADNmt. Contudo esta apenas incluía as mutações presentes na região controlo do ADNmt (Ruiz-Pesini et al. 2007).No ano de 2009, Van Oven e Kayser desenvolveram uma árvore filogenética – Phylotree - que englobava os polimorfismos presentes na região controlo e na região codificante do ADNmt. A Phylotree encontra-se em constante atualização e foi revista pela última vez em Fevereiro de 2014 (van Oven & Kayser 2009). Os ramos mais profundos e antigos dessa árvore incluem haplogrupos característicos do continente Africano, mais especificamente da região Subsariana (Rosa & Brehem 2011). As linhagens mas antigas pertencem ao macrohaplogrupo L, que incluiu os haplogrupos L0, L1, L2, L3, L4, L5 e L6, todos eles específicos de populações Africanas. O haplogrupo L3 ramifica-se nos haplogrupos M e N, que se dispersaram para a região da Eurásia há cerca de 60 000-70 000 anos e deram origem às linhagens presentes nestas regiões. As populações Europeias derivam do haplogrupo N, onde se incluem as linhagens as linhagens H, I, J, K, T, U, V, W e X que, no conjunto, representam 98% da população Europeia. As linhagens Asiáticas derivam tanto do haplogrupo M como do haplogrupo N. No primeiro incluem-se as ramificações C, D, E e Z e no segundo as ramificações A, B, F e J. Nas populações nativas Americanas verifica-se a presença dos haplogrupos A, B, C, e D, característicos da região Asiática, o que indica a sua presença na região Americana, anterior à colonização Europeia (Pinheiro 2010) (Figura 8).

Figura 8 – Mapa representativo da dispersão do Homem por todo o mundo e distribuição geográfica dos haplogrupos de ADNmt (Adaptado de http://www.familytreedna.com)

África apresenta uma grande variabilidade genética que é sugestiva de uma acumulação de mutações durante um longo período de tempo. Os haplótipos europeus apresentam, em média, apenas metade das mutações características das populações Africanas (Micklos & Freyer 2003).

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b. Aplicação forense do ADNmt

Nas últimas décadas a utilização de métodos analíticos que permitem o estudo de ADN, ajudaram a resolver casos em diversas investigações forenses. O estudo de STRs – Short

Tendem Repeats – que têm por base polimorfismos presentes no ADNn, demonstra ser eficaz

quando as amostras biológicas apresentam ADNn em quantidade suficiente e em qualidade desejável. Contudo, na presença de ADN antigo ou de amostras degradas o estudo de STR revela-se inadequado. A análise do ADNmt tem-se revelado eficiente nestes casos particulares, apesar de apresentar um baixo poder de discriminação comparativamente ao ADNn (Butler 2005; Lutz et al. 1996; Wilson et al. 1995; Parson et al. 1998).

Em 1996 a análise de ADNmt foi realizada pela primeira vez em estudos de genética forense, num caso de violação e homicídio em Tenesse, Estados Unidos da América. Sem os resultados obtidos a partir da análise do ADNmt, apenas eram apresentadas evidências circunstanciais contra o suspeito Paul War. Após comparação dos resultados de ADNmt de diversos vestígios com resultados de ADNmt de amostra de referência do suspeito, foi reforçada a hipótese do seu envolvimento no crime (Davis 1998).

Um dos casos mais populares envolvendo o estudo do ADNmt, foi o da identificação de restos cadavéricos pertencentes a indivíduos da família Romanov. Os ossos de czar Nicholas II encontravam-se enterrados há mais de 70 anos, contudo foi obtida uma coincidência entre as sequências da região controlo do ADNmt de czar Nicholas II e de familiares da sua linhagem materna. Esta similaridade de sequências verificou-se, excetuando uma alteração heteroplasmica na posição 16169 da região HVI. Posteriormente verificou-se que essa heteroplasmia estava também presente numa amostra de ADNmt pertencente ao irmão de czar, Georgij Romanov.

A análise de ADNmt em investigações forenses, apresenta vantagens e desvantagens. Em casos onde o objetivo seja a comparação entre familiares da mesma linhagem materna, este marcador genético é adequado. Contudo, por outro lado, não é possível definir a identidade individual de cada sujeito uma vez que indivíduos da mesma linhagem materna apresentam o mesmo haplótipo (Pinheiro 2010).

Na comparação entre haplótipos de ADNmt em perícias forenses são consideradas três possíveis conclusões. A exclusão é determinada quando as sequências diferem em duas ou mais posições nucleotídicas (não incluindo heteroplasmia de comprimento) e duas amostras podem ser excluídas como tendo a mesma origem. Uma comparação inconclusiva resulta da diferença de apenas uma única posição nucleotídica entre sequências. Por outro lado, duas amostras não se podem excluir como tendo a mesma origem ou a mesma linhagem materna, se apresentarem a mesma sequência (partilham bases de ADN comum em cada posição nucleotídica, incluindo variações de comprimento comum) (Scientific Working Group on DNA Analysis Methods 2013).

Na obtenção de perfis de ADNmt de uma mostra de referência e de uma amostra de vestígio, que não se podem excluir como tendo a mesma origem, os haplótipos devem ser

24 introduzidos numa base de dados de ADNmt por forma a fornecer informação estatística sobre a frequência do haplótipo na população.