Aprisionamento no interior de um suporte poroso

Os métodos de aprisionamento são baseados na inclusão e retenção das células dentro de uma rede rígida, interstícios das fibras ou poros do suporte, tendo como objetivo, impedir a difusão das células no meio sem o impedimento da transferência de nutriente e metabólitos (KOURKOUTAS et al., 2004).

A diferença existente entre este método e o anteriormente apresentado consiste que, neste último, as células ficam apenas envoltas por uma membrana e não tendo uma malha entre as células por ela envolvidas (CHAMPAGNE et al., 1994; KRISHNAN et al., 2001).

Esta encapsulação do micro-organismo, que também pode ser denominada como imobilização em partículas, é um processo pelo qual as células são retidas dentro de esferas poliméricas semi-permeáveis e permanecem uniformemente distribuídas dentro delas (KNAEBEL et al., 1997).

Os polímeros usualmente empregados são: o alginato, goma gelana, carragenana, agarose, poliuretano, poliacrilamida e metacrilato (KNAEBEL et al., 1997). O tamanho das partículas formadas pode variar de muito pequenas (aproximadamente 2 a 10 μm de diâmetro) a muito grandes (aproximadamente 3 mm), sendo este fator dependente do polímero, da velocidade de fluxo, da densidade da solução polimérica e da concentração da solução iônica (KNAEBEL et al., 1997; WANG et al., 2005). O polímero escolhido e o tamanho da partícula que este formará influenciam na atividade celular, retenção, difusão de nutrientes e na sua estabilidade (WANG et al., 2005).

A utilização de células encapsuladas ao invés das formulações feitas com células livres é mais vantajosa para sua aplicação no meio ambiente, uma vez que promove a proteção do estresse biótico (predação por protozoários e bacteriófagos) e abiótico (efeito inibitório dos compostos tóxicos). Além disso, garante a sobrevivência dos micro-organismos, promove sua atividade fisiológica, aumenta a densidade e o crescimento celular preferencial nas zonas aeróbias e anaeróbias do gel encapsulado (PASSOS, 2006).

O alginato é um dos suportes mais empregados na imobilização de células microbianas inteiras por se tratar de uma metodologia simples e acessível, além de ser considerada uma técnica reprodutível que requer condições suaves durante o processo de imobilização (KAWAGUTI; SATO, 2008). Como exemplos podem ser citados as produções de carotenóides pelo fungo filamentoso Giberella fujikuroi (GARBAYO et al., 2003) e de ácido lático por Lactobacillus casei (YOO et al., 1996).

Este suporte é formado por heteropolímeros lineares de ácidos carboxílicos (Figura 7), sendo estes compostos de subunidades monoméricas de β-D-ácido manurônico (M) e α-L-ácido glurônico (G) interligados por ligações 1,4-glicosídicas (KAWAGUTI; SATO, 2008).

Figura 7. Composição de alginatos: (a) cadeia de resíduos de ácidos manurônicos; (b) cadeia de resíduos de ácidos glurônicos; (c) cadeia de resíduos de ácidos manurônicos e ácidos glurônicos alternados. Fonte: adaptado de KAWAGUTI; SATO, 2008.

Para que ocorra a formação de um gel firme por este mecanismo clássico de imobilização, a suspensão do micro-organismo é misturada a uma solução formada por um composto polimérico de cargas negativas, como o alginato de sódio. Esta mistura é submetida à extrusão com o auxílio de mangueiras e bomba peristáltica, sendo posteriormente, gotejada em solução que apresente sais de íons bivalentes, como o cloreto de cálcio, havendo assim, a formação dos grânulos. Após a gelificação, os micro-organismos se apresentam retidos ou aprisionados dentro do gel (WANG et al., 2005), conforme ilustrado na Figura 8.

Figura 8. Formação do gel de alginato de cálcio por engaiolamento. Fonte: COVIZZI, 2007.

Os íons cálcio são transportados para o centro da esfera durante a permanência dos grânulos na solução salina, e este mecanismo ocorre até que o estado de equilíbrio seja atingido, podendo demorar de 15 minutos a 12 horas (HULST; TRAMPER, 1989). A duração dependerá das condições experimentais empregadas, tais como: temperatura, concentração do sal, diâmetro da esfera, tipo e concentração do alginato e da suspensão celular. No processo de maturação da esfera seu volume pode ser aumentado em até 40% do tamanho original (OGBONNA et al., 1989).

Alguns aspectos são de suma importância neste processo de imobilização, devendo assim ser observados, os quais são: estabilidade mecânica, que pode ser diminuída com o tempo devido à baixa concentração de alginato ou à grande quantidade de células na suspensão; limitações difusionais, dependendo do tipo e concentração do gel (BAHULEKAR et al., 1991).

Uma causa freqüente do rompimento e até mesmo dissolvimento dos grânulos de alginato trata-se da quelação dos íons cálcio a outros compostos do meio, principalmente íons fosfato e citrato; fato que pode ser minimizado ao adicionar uma maior quantidade de íons Ca2+ na solução ou por um tratamento feito com quitosana (YOO et al., 1996).

A atividade apresentada pelas células imobilizadas é influenciada por algumas características do suporte, podendo enumerar: tamanho da superfície das esferas, porosidade do gel e hidrofilicidade. A polietilenoimina é uma amina polimérica alifática que atua como agente de reticulação, sendo empregada nas técnicas de imobilização para garantir a hidrofilicidade e uma maior força mecânica ao processo. Na formação das esferas de alginato de cálcio, o glutaraldeído constitui-se como agente de ligação, recebendo a denominação de aditivo (BAHULEKAR et al., 1991).

Preetha e Viruthagiri (2005) com a finalidade de estudar a biossorção de íons zinco (II), presentes em solução, por Rhizopus arrhizus, imobilizaram a biomassa do fungo, utilizando como suporte o alginato de cálcio. Concluíram que existe uma relação diretamente proporcional entre a capacidade biossortiva e a quantidade de biossorvente empregada.

Jamai et al. (2001) compararam a produção de etanol das células livres e imobilizadas de Candida tropicalis e Saccharomyces cerevisiae, avaliando para as duas espécies suas taxas de respiração aeróbia e de crescimento, imobilização e tolerância ao etanol, durante o processo fermentativo. Concluíram que a concentração de etanol no fim do ciclo da fermentação é similar para células livres e imobilizadas de Candida tropicalis, mas o tempo requerido para alcançar esses valores é maior para células imobilizadas, enquanto que Saccharomyces cerevisiae, livres e imobilizadas alcançaram a fermentação completa no mesmo tempo. As Candida tropicalis imobilizadas requereram 2-3 h a mais que as células livres de Candida tropicalis para o processo completo da fermentação.

Gillet et al. (2000), com o objetivo de produzir Scopolin, imobilizaram Nicotiana tabacum em esferas de alginato de cálcio, visto que a suspensão de células livres acumulava Scopolin no interior citoplasmático e para a recuperação era necessário seu rompimento celular. As células de N.tabacum imobilizadas produziram mais Scopolin que a suspensão de células

livres, sendo que uma grande fração do produto pode ser recuperada sem o rompimento celular, obtendo 3,8 mg/g de biomassa no meio de cultura para 0,2 mg/g de biomassa intracelular. Diante disso, chegaram a conclusão de que a imobilização de N.tabacum oferece perspectivas para a produção do Scopolin ou a melhora da produção de outros metabólitos secundários da planta, em nível industrial.