Após a extração, os dentes foram limpos com uma gaze umedecida em soro fisiológico e imediatamente armazenados em Karnovsky, solução fixadora composta de glutaraldeído a 2,5% e paraformaldeído a 2,0%, em 0,1M tampão cacodilato, pH 7.0. Em seguida, os dentes foram montados em discos de resina, apoiados por uma das faces proximais e fixados pela porção coronária e radicular com cera pegajosa, evitando-se a contaminação das lesões. Os dentes foram, então, seccionados transversalmente aos seus longos eixos, removendo-se parte da coroa e da raiz, preservando apenas a região correspondente ao terço cervical contendo a LCNC. As faces vestibulares e linguais foram separadas seccionando-se os espécimes no sentido mésio-distal na máquina de corte (Modelo 650- SBT – South Bay Technology - San Diego/Califórnia) (Fig.2), com um disco diamantado (Extec Corp - 102mm X 0.3mm X 12.7mm, Enfield/USA), sob refrigeração abundante, sem ultrapassar os limites da lesão. Em seguida, foram novamente armazenados na solução de Karnovsky, devidamente identificados para o posterior reconhecimento das faces vestibulares e linguais.
Em etapa subseqüente, os segmentos vestibular e lingual foram, por sua vez, divididos no sentido do longo eixo da lesão, em duas partes, de forma que cada dente contribuiu com quatro amostras: duas mesiais (uma vestibular e uma lingual) e duas distais, da mesma forma, uma vestibular e outra lingual. As amostras homólogas mesiais (vestibular e lingual) e distais (vestibular e lingual) foram agrupadas conforme o método de secção e o tratamento das superfícies a serem estudadas, conforme será descrito mais adiante. Assim, foram constituídos 3 grupos e seus respectivos sub-grupos, com o mínimo de 8 e o máximo de 10 amostras cada um (Fig.3).
Figura 3 – Seqüência de preparo dos espécimes de todos os grupos, para posterior seqüência de tratamentos das superfícies dentárias a serem analisadas. A- Dente após a extração. B- Remoção das partes coronárias e radiculares e armazenamento em solução Karnovsky. C- Segmento dental correspondente ao terço médio dos dentes, onde se localizam as lesões cervicais não cariosas. D- Faces vestibulares separadas das faces linguais. Divisão das lesões cervicais não cariosas e faces linguais em mesial e distal, seccionando com disco diamantado (GrupoI) ou fraturando (Grupo II eIII) E- Grupos formados após divisões dos segmentos. Todos os grupos A eram constituídos pelas faces mesiais (vestibulares e linguais homólogas) e os grupos B pelas faces distais (vestibulares e distais homólogas)
Os espécimes de todos os grupos foram lavados em tampão cacodilato de sódio (Electron Microscopy Science, Hatfield/USA) a 0,1M, pH 7.4, realizando-se três banhos de 20 minutos. Os espécimes foram, então, pós-fixados na seguinte ordem:
14 dentes A B C D Grupo IA 10 espécimes Grupo IB 10 espécimes Grupo IIA 10 espécimes Grupo IIB 10 espécimes Grupo IIIA 8 espécimes Grupo IIIB 8 espécimes
Solução Karnovsky Espécimes submetidos à pós-fixação
conforme descrito abaixo Remoção da coroa e raiz
Grupo I 5 segmentos dentais Grupo II 5 segmentos dentais Grupo III 4 segmentos dentais E
-pós-fixação 1 - solução aquosa de tetróxido de ósmio a 1%, por duas horas, em temperatura ambiente.
-lavagem - água destilada, por 10 minutos.
-solução mordente intermediária - ácido tânico a 1% (LabSynth Produtos para Laboratórios Ltda, SP/Brasil), por duas horas, em temperatura ambiente.
-pós-fixação 2 – solução aquosa de tetróxido de ósmio (Koch Instrumentos Científicos Ltda – SP/Brasil) a 1%, por 2 horas, em temperatura ambiente.
-lavagem – 3 banhos de água destilada, por 10 minutos cada.
Grupo I – Espécimes seccionados.
Os espécimes do Grupo I foram seccionados com disco diamantado, longitudinalmente ao dente, no sentido vestíbulo-lingual, separando a LCNC, assim como a face lingual correspondente, conforme descrito acima, em porção mesial e distal. Para tanto, os segmentos dentais foram novamente montados em discos de resina com cera pegajosa, com os mesmos cuidados descritos anteriormente.
Grupo IA – Constituído 10 amostras mesiais (5 vestibulares e 5 linguais homólogas) , as superfícies seccionadas dos espécimes desse grupo foram polidas em seqüência com discos de lixa de carbeto de silício (Extec Abr Disc SiC W/D 8” - Extec Corp. – Enfield/USA), de granulação 800 e 1200, seguidos de disco de feltro e pasta de diamante (Extec I Diamond Compound - Extec Corp. - Enfield/USA), montados na máquina politriz (Modelo APL-4, Arotec S.A. Indústria e Comércio – SP/ Brasil) . Em seguida, as amostras foram armazenadas em tubos Eppendorff contendo água deionizada e submetidas ao ultra-som por 15 minutos.
Grupo IB – As amostras distais, formadas por 5 amostras vestibulares e 5 linguais, foram submetidas aos mesmos tratamentos do grupo anterior, exceto pelo fato de que, após o ultra-som (Ultrasonic-Cleaner – Arotec S.A. Indústria e Comércio – SP/Brasil) por 15 minutos, tanto a superfície da lesão como a superfície seccionada, foram secas com papel absorvente, condicionadas com ácido fosfórico a 5% (Pharmácia Specífica- Bauru/SP), por 15 segundos, e lavadas com água deionizada pelo dobro do tempo de condicionamento.
Grupo II – Espécimes fraturados.
Diferentemente do Grupo I, os espécimes do Grupo II foram fraturados no sentido ocluso-gengival, de maneira que, na vestibular, a fratura se desse dividindo a lesão ao meio. Para orientar a fratura, foram feitas canaletas de orientação nas extremidades oclusal e
gengival dos espécimes. As fraturas foram realizadas com o auxílio de alicate 141 de ponta reta (Duflex - SSWhite) e chave de fenda.
Grupo IIA – Também constituído de 10 amostras mesiais (5 vestibulares e 5 linguais), foram tratadas de forma semelhante ao Grupo IA, entretanto, submetidas ao ultra-som por 30 minutos.
Grupo IIB – Os espécimes (10 amostras distais, 5 vestibulares e 5 linguais) desse grupo foram simplesmente submetidos ao condicionamento com ácido fosfórico a 5%, por 15 segundos, tanto na superfície fraturada quanto na superfície da lesão.
Grupo III – Espécimes fraturados.
Os espécimes foram fraturados da mesma forma descrita no Grupo II.
Grupo IIIA – Nenhum tratamento foi realizado nos espécimes desse grupo, que serviram como controle. Esse grupo foi composto de 8 amostras mesiais (4 vestibulares e 4 linguais)
Grupo IIIB – Após fratura, os espécimes, no total de 8 distais, sendo 4 vestibulares e 4 linguais, foram imersos em hipoclorito de sódio a 2% (Pharmácia Specífica- Bauru/SP), por 5 minutos.
A tabela 3 permite melhor visualização dos tratamentos realizados nos diferentes
grupos.
Tabela 3 – Seqüência do processo de fixação e tratamento que cada grupo recebeu
Grupos
1-Lavagem: 3 banhos de 20 min com tampão cacodilato 2-Pós-fixação com tetróxido de ósmio-2h
3-Lavagem com água destilada – 10min 4-Lavagem em ácido tânico-2h
5-Pós-fixação com tetróxido de ósmio-2h
6-Lavagem com água destilada – 3 banhos de 10min
No de espécimes Tratamento Grupo I (Seccionado) Grupo IA 10 Ultra-som Grupo IB 10 Ultra-som + H3PO4, 5% Grupo II (Fraturado)
Grupo IIA 10 Ultra-som Grupo IIB 10 H3PO4, 5% Grupo III (Fraturado)
Grupo IIIA 08 Sem tratamento Grupo IIIB 08 NaOCl 2%, 5 min.
4.3 PREPARO DOS ESPÉCIMES PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE