Testes de susceptibilidade antimicrobiana e caracterização molecular de resistência à rifampicina em B. abortus e B. canis
Ester Souza Lopes,a Cristina Tonial Simões,a Verônica Machado,a Marisa da Costaa#
Departamento de Microbiologia, Parasitologia e Imunologia (DeMIP), Programa de Pós Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brazila
Resumo
A brucelose é uma doença infecciosa que afeta diversas espécies animais e pode ser transmitida para humanos, podendo causar doenças crônicas com o envolvimento de múltiplos órgãos e baixa mortalidade. O tratamento exige uma combinação de dois antimicrobianos, sendo doxiciclina e rifampicina os principais antimicrobianos recomendados pela Organização Mundial da Saúde. Casos esporádicos de resistência à rifampicina têm sido relatados. Neste estudo testamos a susceptibilidade antimicrobiana de 52 cepas de B. abortus e sete de B.
canis para o antimicrobiano rifampicina, através das técnicas de microdiluição em caldo e de E-
test e encontramos divergência na Concentração Inibitória Mínima (CIM) entre estes testes em 21% das cepas analisadas. Realizamos a avaliação do fenótipo de super expressão de bomba de efluxo testando a atividade de carbonil cianida m-clorofenilhidrazona (cccp) e observamos redução da CIM na presença de cccp nas oito cepas que apresentavam suscetibilidade diminuída à rifampicina. Investigando a presença de mutações que poderiam levar ao desenvolvimento do fenótipo rifampicina-resistente (RifR) em Brucella, encontramos duas
mutações no gene rpoB. Verificamos a presença do gene bepC em 100% das cepas de B.
abortus e B. canis testadas, porém a inibição do mecanismo de efluxo pelo cccp foi observado
em apenas 15% das cepas de B. abortus, indicando a inatividade deste gene em algumas cepas.
Introdução
A brucelose em humanos é adquirida por inalação, contato com secreções de animais contaminados, consumo de produtos lácteos não pasteurizados e produtos cárneos não maturados e mal cozidos, estabelecendo-se via cutânea, respiratória ou rota gastrointestinal. É considerada uma doença de risco ocupacional para fazendeiros, veterinários, trabalhadores de abatedouros, laboratoristas e outros que trabalham com animais ou que entram em contato com seus tecidos ou produtos não processados ou maturados. A prevalência de brucelose em humanos depende de vários fatores como hábitos alimentares, métodos de processamento de leite e derivados, práticas de manejo e higiene do ambiente (1, 2, 3, 4).
Embora a brucelose raramente seja fatal em seres humanos, pode ser severamente debilitante e incapacitante, pois se trata de uma doença febril que pode ser confundida com outras doenças, tanto infecciosas como não infecciosas, incluindo febre entérica, malária, febre reumática, tuberculose, colecistite, tromboflebite, infecção fúngica, doença auto-imune e tumores (5, 6, 7). A terapia antimicrobiana é útil para encurtar o curso natural da doença, reduzindo as complicações e prevenindo recidivas. O tratamento da brucelose exige uma combinação de dois antimicrobianos: principalmente doxiciclina e rifampicina ou doxiciclina e estreptomicina por longos períodos (8).
A rifampicina (RIF) é um potente antimicrobiano no tratamento de infecções por
Brucella e é amplamente aceito na terapia de primeira linha; é o único antimicrobiano com
atividade aumentada em condições ambientais ácidas, além de ter uma boa penetração intracelular e sinergismo evidente em terapias combinadas (9, 10, 11, 12). O alvo da RIF em procariotos é a subunidade β da RNA polimerase DNA-dependente (RNAP) codificada pelo o gene rpoB e sua atividade bactericida deriva da sua alta afinidade em ligar e inibir a RNAP bacteriana (13, 14, 15). Além da RIF o gene rpoB é um alvo para lipiarmicina, estreptolidigina e microcina J25 (16, 17, 18, 19, 20). Mutações distintas envolvendo regiões conservadas foram
identificadas em diferentes espécies bacterianas que apresentaram algum grau de resistência à RIF (17, 21, 22, 23, 24). Apesar dos isolados de Brucella serem geralmente considerados susceptíveis aos antimicrobianos recomendados pela OMS, casos esporádicos de resistência, incluindo a RIF, têm sido relatados, sendo desvantagem o rápido aparecimento de cepas resistentes com seu uso (25, 26, 27, 16).
Outro gene que demonstrou estar envolvido na resistência de Brucella é o gene bepC (homólogo da proteína tolC). Um estudo demonstrou que a presença do gene bepC resultou em redução da susceptibilidade para compostos hidrofóbicos, tais como ampicilina, eritromicina, rifampicina, rodamina 6G e brometo de etídio (28, 29).
Testes de susceptibilidade antimicrobiana para Brucella sp. não são geralmente recomendados para rotina de laboratórios de Microbiologia pela baixa frequência de resistência relatada para cada espécie, exceto em risco de vida, tais como endocardite e meningite brucélica, no caso de falha no tratamento e recidivas (30, 31). Outro problema é a falta de padronização para estes testes. O CLSI lançou os primeiros padrões interpretativos de CIM para Brucella sp. em janeiro 2006 (32), porém não estabelece parâmetros para RIF. A eficácia
in vitro de antibióticos contra Brucella sp. tem sido testada geralmente com base na
determinação de valores de CIM por métodos de microdiluição em caldo, diluição em ágar e E- test (9, 33, 34).
A resistência pode ser considerada um fenômeno ecológico que ocorre como resposta da bactéria frente ao amplo uso de antimicrobianos e sua presença no meio ambiente (38). O uso extensivo e muitas vezes inapropriado dos antimicrobianos, más condições de higiene, fluxo contínuo de viajantes, o aumento de pacientes imunocomprometidos e a demora no diagnóstico das infecções bacterianas têm favorecido o aumento da resistência (37). A resistência aos antimicrobianos é um problema global e emergente e estudos com o objetivo de identificar os mecanismos de resistência aos antimicrobianos em Brucella sp, são escassos, porém conhecer os mecanismos bioquímicos e genéticos envolvidos na resistência é de grande importância, pois possibilita o desenvolvimento de estratégias que podem ser adotadas para evitar o desenvolvimento de resistência. Além disso, a caracterização dos genes responsáveis pela resistência, assim como sua localização e diversidade são de grande importância para o entendimento dos fatores envolvidos (36). Este trabalho teve como
objetivos: (i) testar a susceptibilidade antimicrobiana das cepas de B. abortus e B. canis da coleção do DeMIP – UFRGS (cepas de referência e campo), à RIF através das técnicas de microdiluição em caldo e de E-test com o objetivo de comparar os resultados obtidos em ambos os testes; (ii) realizar a avaliação do fenótipo de super expressão de bomba de efluxo testando a atividade de carbonil cianida m-clorofenilhidrazona (cccp) na possibilidade de redução de CIM à RIF em cepas de Brucella com fenótipo de susceptibilidade diminuída através do método de microdiluição em caldo; (iii) detectar a presença do gene bepC; (iv) investigar os eventos moleculares que levam ao desenvolvimento do fenótipo rifampicina- resistente (RifR) em Brucella sp. através da análise do gene rpoB .
Materiais e métodos
1. Testes de susceptibilidade antimicrobiana à RIF:
1.1. Cepas: foram avaliados os perfis de 52 cepas de B. abortus, sendo11 de
referência e 41 de campo, todas isoladas de bovinos, e sete de B. canis (uma de referência e seis isoladas de cães) da coleção do DeMIP - UFRGS.
1.2. Microdiluição em caldo: em microplacas de cultura de 96 poços com fundo
chato, foi inoculado caldo Brucella não suplementado contendo diferentes concentrações (32, Tabela 6A) de RIF (Sigma-Aldrich, USA) com suspensões de organismos testes equivalente à turbidez 0,5 da escala de McFarland seguido de incubação a 37ºC durante 48h, seguindo as recomendações do CLSI para os potenciais agentes de bioterrorismo (32, Tabela 2K).
1.3. E-test: ágar Mueller-Hinton (Oxoid, England) suplementado com 5-10% de
sangue ovino citratado foi inoculado com suspensões de organismos testes equivalente à turbidez 0,5 da escala de McFarland; tiras de RIF E-test (BioMérieux, France) foram aplicadas sobre aos meios inoculados. As placas foram incubadas a 37ºC e lidas após 48h. A CIM foi interpretada com o valor pelo qual a zona de inibição interceptou a escala na tira do E-test.
Os critérios interpretativos do CLSI para bactérias de crescimento lento (Haemophilus) foram levados em consideração para avaliar os resultados das CIMs (32, Tabela 2E). As cepas foram consideradas sensíveis quando os valores de CIM foram ≤1µg/mL, resistentes quando
≥4µg/mL e intermediários quando apresentaram valores entre estes extremos. Todos os testes foram realizados em triplicata.
2. Avaliação do fenótipo de super expressão de bomba de efluxo:
2.1. Cepas: foram submetidas ao experimento as cepas que apresentaram
susceptibilidade diminuída à rifampicina no experimento de microdiluição em caldo (n=8).
2.2. Determinação de concentração não tóxica de cccp para Brucella: foi
realizada uma curva de concentração de cccp em microplacas de cultura de 96 poços com fundo chato, onde caldo Brucella (Acumedia, USA) não suplementado contendo diferentes concentrações de cccp (0 a 110µM) (Sigma- Aldrich, USA) foi inoculado com suspensões de organismos testes, equivalente à turbidez 0,5 da escala de McFarland, seguido de incubação a 37ºC durante 48h. A concentração mais alta de cccp, que não inibiu o crescimento de
Brucella foi utilizada no experimento.
2.3. Microdiluição em caldo com inibidor de bomba de efluxo: o teste foi
realizado conforme o experimento de microdiluição em caldo descrito anteriormente. Em cada poço, além de RIF também foram adicionados 90µM de cccp (35).
3. Detecção da presença do gene bepC:
3.1. Cepas: Todas as 52 cepas de B. abortus e as sete cepas de B. canis foram
utilizadas neste experimento.
3.2. Ensaio de PCR e eletroforese: Os primers e as condições de amplificação foram
realizadas conforme descrito anteriormente (29). Buscando amplificar uma região de DNA de 1.932bp foram utilizados os primers 5’ (GAA CGG GAT GAC GGG AA) e 5’ (GGC GTA CCG TTT TCA ATG CA) As amplificações de PCR foram realizadas com o kit Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Brasil) seguindo o protocolo do fabricante no termociclador Mastercycler Personal (Eppendorf).
4. Análise do gene rpoB:
4.1. Cepas: cepas que apresentaram susceptibilidade diminuída a RIF nos testes de
microdiluição (n=8) e E-test (n=4) e três cepas sensíveis.
4.2. Ensaio de PCR e eletroforese de dois “hotspots” dentro do gene rpoB: dois
testes de PCR foram realizados para amplificar duas regiões específicas no gene
rpoB, como descritos anteriormente (22). A primeira região correspondente aos
códons 118 a 240 foi amplificada pelos primers +354rB e -720rB para se obter um produto de 367bp. A segunda (denominada região central), localizado no centro do gene, correspondente aos códons 473 a 606, foi amplificado pelos oligonucleotídeos iniciadores +1418rB e -1818rB para se obter um produto de 401 bp. Os primers e as condições de amplificação foram feitos conforme Marianelli et al. (2004). As amplificações de PCR foram realizadas com o kit GoTaq DNA Polymerase (Promega, USA) segundo o protocolo do fabricante. O DNA foi amplificado em Mastercycler Personal (Eppendorf).
Todos os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão TBE 0,5X. O tamanho dos fragmentos de DNA amplificados foram estimados por fluorescência em comparação com o marcador 100bp DNA Ladder (Ludwig, Brasil) pelo programa Kodak 1D versão 3.5.2.
4.3. Purificação dos fragmentos de DNA: os fragmentos foram purificados
utilizando o kit Invisorb Fragment CleanUp (Invitek, Alemanha) conforme recomendações do fabricante.
4.4. Sequenciamento e análise de dados: o sequenciamento foi realizado por
Macrogen Advancing Through Genomics (Coréia). As sequências geradas foram analisadas no programa Chromas Lite 2.1.1 e alinhadas entre si no programa Mega 5.05. As sequências nucleotídicas foram alinhadas e comparadas com o genoma de B. melitensis 16M (AE009516, substituído por AE008917) utilizado como referência em estudos anteriores no programa BLASTn (Basic Local Alignment Search Toll). O programa tBLASTtx foi utilizado para tradução das
sequências de nucleotídeos em sequências de aminoácidos e alinhamento com
B. melitensis 16M (AE009516, substituído por AE008917).
4.5. Números de acesso das sequências de nucleotídeos: as sequências de
nucleotídeos geradas no presente estudo foram depositadas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank) e os números de adesão estão relatados na Tabela 1.
Resultados
1. Testes de susceptibilidade antimicrobiana para rifampicina:
Todas as sete cepas de B. canis apresentaram susceptibilidade tanto no E-test quanto na microdiluição em caldo. Houve concordância de resultados com 41 das cepas de B. abortus testadas (79%), sendo uma cepa (13/03) com resultados de susceptibilidade intermediária e 40 cepas sensíveis ao antimicrobiano testado. Houve divergência nos resultados obtidos com 11 cepas de B. abortus que apresentaram perfis de susceptibilidade diferentes nos testes comparados. No E-test foram detectadas susceptibilidade reduzida em quatro cepas (8p/04, 14/02, NB135 e VM551) sendo que todas estas cepas foram susceptíveis no teste de microdiluição. Uma cepa (870) apresentou perfil RIFR no E-test e intermediário no teste de microdiluição. Enquanto que no teste de microdiluição em caldo foi detectada susceptibilidade reduzida (intermediária) em oito cepas (544, 1119-3, 870, 17a/02, 13/03, 02/06, NB94 e am.75), sendo as mesmas susceptíveis no E-test.
2. Avaliação do fenótipo de super expressão de bomba de efluxo:
Verificamos que a menor concentração de cccp onde não foi observada atividade inibitória sobre o crescimento de Brucella foi de 90µM.
Todas as oito cepas de B. abortus (544, 1119-3, 870, 17a/02, 13/03, 02/06, NB94 e am.75) que apresentaram susceptibilidade reduzida no teste de microdiluição em caldo, quando submetidas ao experimento de avaliação do fenótipo de super expressão de bomba de efluxo, apresentaram redução de CIM na presença de cccp de 2,0µg/mL para valores iguais ou inferiores a 1µg/mL de RIF.
3. Detecção da presença do gene bepC:
O fragmento contendo 1.932bp correspondente ao gene bepC foi observado em 100% das cepas de B. abortus e B. canis testadas.
4. Análise do gene rpoB:
Os “hotspots” do gene rpoB foram caracterizadas molecularmente em 15 cepas de B.
abortus, sendo 12 (02/06, 1119-3, 13/03, NB94, VM551, NB135, 14/02, 17a/02, 544, 870, 8p/04
e am.75) com perfil de susceptibilidade reduzida a RIF e três (56, 292 e B3196) sensíveis ao antimicrobiano, após PCR e sequenciamento de DNA. Na primeira região correspondente aos códons 118 a 240 foi detectada mutação no códon 220 somente na cepa 870, em que ocorreu uma substituição de nucleotídeos de GAA para CAA resultando em uma mutação de sentido trocado (missense) alterando o aminoácido de ácido glutâmico para glutamina. No segundo fragmento, localizado no centro do gene, correspondente aos códons 473 a 606 foi encontrada uma mutação no códon 549, onde ocorreu uma substituição de nucleotídeos de ACC para ACT, resultando em uma mutação silenciosa que mantém o aminoácido treonina, em duas cepas que apresentaram susceptibilidade reduzida (17a/02 e 870) a RIF e nas três cepas susceptíveis (56, 292 e B3196) submetidas ao PCR e sequenciamento do gene rpoB.
Discussão
Alguns estudos indicam que o método do E-test mostrou-se confiável, reprodutível, menos trabalhoso, mais rápido e prático quando comparado com o método de microdiluição em caldo (9, 33, 34), porém em nosso estudo encontramos divergência entre os resultados dos dois testes em 21% das cepas de B. abortus testadas. Nossos resultados indicam que o método padrão não deve ser substituído pelo E-test para testar a RIF em procedimentos relacionados à rotina clínica, pois há possibilidade de resultados falso positivo ou negativo, podendo acarretar em complicações e riscos ao paciente.
Um estudo anterior (29) investigou o papel do gene bepC, o único membro da família TolC identificado no genoma de B. suis, onde utilizando uma abordagem mutacional de resistência de Brucella à RIF, foi demonstrado que o gene bepC está envolvido no efluxo de vários antibióticos. Estes autores demonstraram que mutantes deficientes de bepC
apresentaram capacidade reduzida de expulsar compostos tóxicos e relativamente hidrofóbicos, influenciando a sobrevivência de B. suis no interior do hospedeiro. A presença do gene bepC resultou em uma redução considerável da susceptibilidade para compostos hidrofóbicos, tais como ampicilina, eritromicina, rifampicina, rodamina 6G e brometo de etídio, e pode contribuir também para a resistência aos compostos naturalmente presentes no hospedeiro mamífero, tais como sais biliares e esteroides (29). Em nosso estudo verificamos a presença do gene bepC em 100% das cepas de B. abortus e B. canis testadas, porém a inibição do mecanismo de efluxo foi observada em apenas oito cepas com susceptibilidade diminuída de B. abortus, confirmando que este mecanismo de resistência está ativo nestas cepas. Portanto apenas a presença do gene bepC não é fator determinante para a presença deste mecanismo, pois o gene pode estar presente, porém não estar expressando a proteína que seria por ele codificada.
A investigação de mutações que poderiam estar envolvidas na resistência intermediária a RIF encontrada em oito cepas de B. abortus (544, 1119-3, 870, 17a/02, 13/03, 02/06, NB94 e am.75) sugere que o fenótipo de resistência destas cepas pode não ser resultante das mutações detectadas nas regiões estudadas do gene rpoB, a não ser que esteja em outro ponto do gene. Não há relato na literatura sobre a mutação “missense” encontrada no códon 220 do gene rpoB da cepa 870 (ácido glutâmico glutamina), porém observamos que apenas esta cepa apresentou fenótipo RIFR no E-test, sendo uma peculiaridade a ser investigada a fim de determinar a relação desta mutação com a resistência. A mutação silenciosa encontrada no códon 549 do gene rpoB das cepas 17a/02 e 870 com perfil de resistência intermediária a RIF, e nas três cepas susceptíveis (56, 292 e B3196) já foi descrita em estudo anterior (23) nas cepas B3196, 870 e C68 e não está relacionada com o fenótipo de resistência, uma vez que se encontra presente também em cepas sensíveis.
Nosso estudo sugere a presença de mecanismo de efluxo ativo envolvido na resistência de B. abortus a RIF, pois ao utilizarmos o inibidor de bomba de efluxo (cccp) como "adjuvante ou composto auxiliar" em combinação com o antimicrobiano, foi observada uma certa restauração no nível de atividade antimicrobiana resultando na redução de CIM. A inibição da atividade da bomba de bactérias Gram-negativas pode ser conseguida por diferentes maneiras. Vários compostos são capazes de recolher a energia necessária para o
transporte de drogas. Entre eles, o cccp pode afetar seriamente o nível de energia da membrana bacteriana e são usados no laboratório para suprimir totalmente o efluxo de várias drogas, constituindo uma abordagem eficaz para reverter a resistência, uma vez que induz um aumento significativo na susceptibilidade ao antimicrobiano.
O efluxo do agente antimicrobiano pode conferir um nível residual de resistência. Este mecanismo pode não ser suficiente para expressar resistência clínica, porém, em conjunto com outros mecanismos pode estar na origem de falhas terapêuticas (39). Com frequência bactérias utilizam mais de uma estratégia para evitar a ação dos antimicrobianos; assim, a ação conjunta de múltiplos mecanismos pode produzir um acentuado aumento da resistência.
Há poucos estudos sobre mecanismos de efluxo em Brucella, e estudos nessa área são importantes para se conhecer os diferentes mecanismos que podem estar associados ao fenótipo de resistência a diferentes antimicrobianos, bem como o desenvolvimento de estratégias que visem a inibição das bombas envolvidas, objetivando restaurar a susceptibilidade às drogas de cepas resistentes e favorecendo assim a atividade clínica de antimicrobianos que já não são mais utilizados devido ao desenvolvimento de resistência. (35).
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela CAPES, FAPERGS e PROAP / UFRGS.
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