Artigo 1: Diversidade genética de populações naturais brasileiras de Anthonomus

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IV. Artigo 1: Diversidade Genética de Populações Naturais Brasileiras de Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae)

Diversidade Genética de Populações Naturais Brasileiras de Anthonomus

grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae)

Diversidade Genética de Populações Naturais Brasileiras de Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera: Curculionidae)

Martins, W. F. S1.; Ayres, C. F. J2.; Lucena, W. A3

Departamento de Zoologia-UFPE, Recife, PE, Brasil. 2Departamento de Entomologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães-FIOCRUZ; Recife, PE, Brasil. 3Laboratório de Biologia Molecular de Insetos, Embrapa Algodão. Rua Osvaldo Cruz, Centenário, n. 1143, Campina Grande, PB, Brasil. CEP: 58107-720. E-mail: wagner@cnpa.embrapa.br

Resumo

Vinte e cinco loci de RAPD e seis loci de isoenzimas foram analisados para caracterizar a variabilidade genética de sete populações naturais de Anthonomus grandis, provenientes de dois agroecosistemas do Brasil. Os dados de RAPD revelaram um polimorfismo que variou de 52 a 84% e uma heterozigosidade de 0,189 a 0,347. O índice de diferenciação geral entre as seis populações analisadas foi elevado e significativo (GST = 0,258; p <

0,05). A análise de cinco populações através de isoenzimas mostrou um polimorfismo e uma heterozigosidade variando entre 25 e 100% e 0,174 e 0,277, respectivamente. A diferenciação geral entre as populações correspondeu a um FST de 0,544 (p < 0,05). Os

marcadores analisados permitiram distinguir populações oriundas de regiões onde é praticada a agricultura em grande escala, das áreas de pequena escala.

Palavras-chave: Bicudo do algodoeiro, RAPD, Isoenzimas, Variabilidade genética

34 Introdução

O bicudo do algodoeiro Anthonomus grandis Boheman, é a principal praga da cotonicultura mundial. Os primeiros relatos de danos causados por este inseto no algodão cultivado ocorreram em 1880 em Monclava, estado de Cohahuila, México e em 1920 no Arizona, Estados Unidos (BURKE et al., 1986). Na América do Sul, o bicudo do algodoeiro foi inicialmente observado na Venezuela em 1949, entre os países do continente americano, o Brasil foi o último a relatar a presença de A. grandis, em fevereiro de 1983, em plantações de algodão de Santa Bárbara do Oeste, estado de São Paulo (LOZADA et al., 1987).

Atualmente, o bicudo do algodoeiro está presente em quase todas as áreas de cultivo de algodão do Brasil. Os programas de controle mantidos nas três maiores áreas de produção, localizadas nos estados do Mato Grosso e Goiás (região centro-oeste) e Bahia (nordeste), embora não tenham conseguido a erradicação, têm mantido as populações de A.

grandis em baixa densidade populacional. No entanto, nas demais regiões onde prevalece a

agricultura familiar, as populações de bicudo do algodoeiro apresentam nível superior ao de dano econômico, principalmente devido à ausência de programas de controle eficientes.

A caracterização da variabilidade genética das populações de insetos praga, bem como os fatores que mantém esta variabilidade, são aspectos de fundamental importância para a elaboração de programas de controle mais efetivos. Nos últimos vinte anos, os marcadores moleculares têm se mostrado uma grande ferramenta para estudos de genética de populações, biologia evolutiva, taxonomia e biologia da conservação, permitindo a análise da diversidade e diferenciação genética das populações naturais (OOSTERHOUT et al., 2004).

Estudos de diversidade genética em A. grandis são escassos e restritos às populações da América do Norte e Central. Nos primeiros trabalhos de genética de populações de A. grandis foram utilizados marcadores isoenzimáticos (BANCROFT e JONES, 1977; BIGGERS e BANCROFT, 1977; BARTLETT, 1981; TERRANOVA e NORTH, 1985; BARTLETT et al., 1983; TERRANOVA et al., 1991). Bartlett (1981), analisando 12 loci enzimáticos, concluiu que A. grandis thurberiae Pierce, A. grandis Boheman e o bicudo do Arizona constituíam três grupos gênicos distintos com fluxo gênico restrito entre eles.

As análises de variabilidade genética de A. grandis com marcadores de DNA têm sido realizadas basicamente com RFLP-DNAmt (Polimorfismo de Tamanho de Fragmento de Restrição do DNA mitocondrial) e RAPD (Polimorfismo do DNA Amplificado Randomicamente), em abordagens de sistemática molecular (ROEHRDANZ e NORTH, 1992; ROEHRDANZ, 2001) e estrutura genética e dispersão (KIM e SAPPINGTON, 2004 a; 2004 b; SCATAGLINI et al., 2000). Scataglini et al. (2000), utilizando RAPD, analisaram o fluxo gênico e a estrutura genética de nove populações de A. grandis da América do Sul e do Norte. Os dados obtidos revelaram grande semelhança entre as populações de Porto Iguaçu (Argentina) e Tecomán (México), sugerindo uma ligação ancestral entre as duas populações e conseqüentemente, ocorrência natural de A. grandis na América do Sul antes do cultivo extensivo de algodão no continente americano.

Kim e Sappington (2004b) utilizaram RAPD para analisar a estrutura genética de

populações de bicudo do algodoeiro provenientes dos Estados Unidos e México. Os resultados revelaram a ocorrência de fluxo gênico limitado entre as populações das regiões central, ocidental e oriental do Sul dos Estados Unidos; no entanto, o fluxo gênico entre as populações da mesma região separadas por distâncias menores que 300 km foi relativamente constante.

O principal objetivo deste trabalho foi caracterizar a diversidade genética de populações de A. grandis oriundas de cinco estados brasileiros: Paraíba, Ceará, Mato Grosso, Bahia e Goiás através da análise de isoenzimas e RAPD.

Material e Métodos Amostragem

Maçãs e botões florais de algodão com presença de orifício de oviposição foram coletados entre 2002 e 2005 em sete cidades de cinco estados do Brasil (Figura 1, Tabela1): 1) Campina Grande (35º 56’ W, 7º 11’ S) e Patos (38º 11’ W, 7º 18’ S) na Paraíba-PB; 2) Barbalha (39º 18’ W, 7º 18’ S) e Missão Velha (39º 11’ W, 7º 11’ S) no Ceará-CE; 3) Barreiras (44º 56’ W, 12º 11’ S) na Bahia-BA; 4) Primavera do Leste (54º 22’ W, 15º 37’ S) no Mato Grosso-MT e 5) Ipameri (48º 11’ W, 17º 41’ S) em Goiás-GO. O material coletado foi mantido em gaiolas apropriadas no insetário da Embrapa Algodão até a eclosão das larvas e emergência dos adultos de A. grandis Boheman. As larvas e

adultos obtidos foram armazenados em freezer a -20º C até a análise de isoenzimas e extração de DNA.

Extração de DNA e RAPD-PCR

A cabeça de cada inseto adulto foi homogeneizada individualmente em 500 µl de tampão de lise (NaCl 0,4M, EDTA 2mM, Tris-HCl 10mM pH 8,0), proteinase K (150 mg/ml) e Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) 1,5%. O homogenato foi incubado “overnight” a 65º C. Posteriormente, foram adicionados 420 µl de NaCl 5M, e a amostra foi misturada em um agitador tipo “vórtex” por aproximadamente 1 min. Em seguida, foi centrifugada a 14.000 rpm por 20 min a 4º C. Ao sobrenadante foi adicionado igual volume de isopropanol, e a mistura foi mantida a -20º C por 1 h, para precipitação do DNA. Posteriormente, a amostra foi centrifugada a 14.000 rpm por 20 min a 4º C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com etanol 70%, seco a vácuo e resuspendido em 300 µl de Tris-EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM).

Sessenta primers (Operon®) das séries OPA1-20, OPC1-20 e OPM1-20 foram testados. Destes, três: OPA8: 5’-GTGACGTAGG-3’; OPA18: 5’-AGGTGACCGT-3’ e OPC19: 5’-GTTGCCAGCC-3’ foram selecionados por apresentarem a melhor eficiência de amplificação e reprodutibilidade. A reprodutibilidade dos fragmentos obtidos foi testada utilizando o mesmo DNA em três diferentes reações de PCR. Cada reação de amplificação teve um volume final de 25 µl, usando os seguintes componentes: Tris-HCl 10 mM pH 9,0, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 400 pmol de cada oligonucleotídeo, 2U de Taq DNA

polimerase (Amersham), 0,2 mM de cada dNTP e 15 ng de DNA molde. A mistura foi amplificada em um termociclador Tecne® programado para 40 ciclos a 94º C por 1 min, 35º C por 1 min, 72º C por 2 min e um ciclo final de 72º C por 10 min. O produto final da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 0,8% no tampão Tris-Borato- EDTA/TBE (Tris 0,089 M; Ácido bórico 0,0089 M; EDTA 0,002 M, pH 8,3) corado com brometo de etídio, e visualizado em um transiluminador de ultravioleta.

37 Eletroforese de Isoenzimas

Larvas individuais foram homogeneizadas em 500 µl de água destilada. Posteriormente, papéis de filtro (0,5 X 2,5 cm) foram embebidos nos homogenatos protéicos e submetidos à eletroforese nativa em géis horizontais de penetrose 30 (13% de penetrose e 5% de sacarose) em tampão Ácido Cítrico (Ácido Cítrico 0,04 M, Morfolina pH 7,1), seguindo a metodologia descrita por Alfenas et al. (1991). Foram utilizados os sistemas enzimáticos: Isocitrato desidrogenase (IDH, EC 1.1.1.42), Peroxidase (PO, EC 1.11.1.7), Esterase (EST, EC 3.1.1.1), Enzima málica (ME, EC 1.1.1.40) e Malato desidrogenase (MDH, EC 1.1.1.37). Os loci isoenzimáticos foram numerados de acordo com Tabachnick (1979).

Análise Estatística

Para análise dos dados de RAPD, quatro premissas foram assumidas: 1) os alelos apresentam herança mendeliana; 2) as populações estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg; 3) bandas com mesma mobilidade eletroforética são homólogas, e 4) alelos não amplificados são tidos como recessivos. Os loci foram analisados como presente (1) ou ausente (0), não levando em consideração a intensidade das bandas. A partir da matriz binária construída foram calculados: freqüências alélicas, proporção de loci polimórficos e heterozigosidade, utilizando o programa TFPGA versão 1.3 (MILLER, 1997). Os cálculos da distância genética de Nei (1972) e o índice de diferenciação genética (GST)de acordo

com McDermott e McDonald (1993) foram realizados utilizando o programa POPGENE versão1. 32 (YEH e BOYLE, 1997).

A análise dos zimogramas obtidos por isoenzimas foi realizada seguindo a nomenclatura descrita por Tabachnick (1979), onde loci e alelos são designados por números. Os índices de diversidade genética (Heterozigosidade observada-HO e proporção

de loci polimórficos-P) e a distância genética de Nei (1972) foram calculados utilizando o programa GENETIX 4,01 (BELKHIR et al., 2001). A diferenciação genética entre as populações foi estimada através do valor de θ (FST) de Weir e Cockerham (1984),

As estimativas de fluxo gênico foram calculadas a partir da fórmula

Nm _   −    = 1 1 4 1 ST

F . A distância genética entre as populações, obtidas por RAPD e

isoenzimas, foram utilizadas na construção do dendrograma utilizando o método

neighbour-joining no programa MEGA 3 versão 3.0 (KUMAR et al., 2004). A

significância dos valores de FST e GST foi estimada de forma não paramétrica através de

500 permutações com todos os indivíduos.

Resultados RAPD

Os primers selecionados OPA8, OPA18 e OPC19 geraram 8, 8 e 9 bandas respectivamente, possibilitando a identificação de fragmentos entre 320 e 1.700 pares de bases (pb). Dois fragmentos de 1.600 e 1.700 pb gerados pelo iniciador OPA18 foram observados exclusivamente nas populações do nordeste. Os fragmentos de 1.100, 1.300 e 1.400 pb amplificados pelo iniciador OPA8 foram observados apenas nas populações do Ceará e da Paraíba.

A proporção de loci polimórficos e a heterozigosidade observada variaram de 52 a 84% e de 0,189 a 0,347 respectivamente, sendo a heterozigosidade média de 0,262, revelando uma considerável variação genética nas populações (Tabela 1). A diferenciação geral entre as seis populações correspondeu a um GST de 0,258 (p < 0,05) e Nm = 0,72. As

populações do estado da Paraíba (PB) e do Ceará (CE) apresentaram diferenciação genética alta (GST = 0,242; Nm = 0,78) e moderada (GST = 0,150; Nm = 1,42),

respectivamente. Com o objetivo de investigar a diferenciação entre os estados, as subpopulações da Paraíba (PB) e do Ceará (CE) foram agrupadas como uma só população, obedecendo às categorias hierárquicas. A diferenciação genética entre os dois estados correspondeu a um GST de 0,013 (p < 0,05).

A distância genética entre as populações variou de 0,180 a 0,716 (Tabela 2). O dendrograma obtido pelo método neighbor-joining (Figura 2A) baseado na distância genética de Nei (1972), demonstrou dois grupos distintos, um formado pelas populações do Ceará (CE) e outro formado por dois subgrupos, o primeiro constituído pelas populações da Bahia e Goiás e o segundo pelas populações da Paraíba (PB).

39 Isoenzimas

Os cinco sistemas enzimáticos selecionados para análise (ME, EST, MDH, PO e IDH) levaram à identificação de 11 possíveis loci. Est-1, Est-3, Est-4 e Po-2 apresentaram alelos diagnósticos para a população de Primavera do Leste, e o locus Mdh-2 esteve ausente apenas na população de Campina Grande, os loci considerados diagnóstico não foram utilizados nas análises de diversidade e estrutura genética. Os seis loci utilizados: Est-2, Po-1, Mdh-1, Idh-1, Idh-2 e Me-1 foram polimórficos em pelo menos uma população (considerando o critério de 95%, onde a freqüência do alelo mais comum não excede 95%). O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi rejeitado (p < 0,05) em três loci, Po-1 na população de Campina Grande, Idh-1 na população de Missão Velha e Mdh-1 na população de Barbalha. Desvios significantes na distribuição dos genótipos nestes loci também foram observados, após a correção de Bonferroni (ajuste de significância de 5% para 0,00167).

A heterozigosidade média correspondeu a 0,212, enquanto que a heterozigosidade observada nas populações variou de 0,174 em Patos (PB) a 0,277 em Primavera do Leste (MT) e o polimorfismo variou de 25 a 100% (Tabela 1). A diferenciação geral (FST) entre

as cinco populações foi de 0,544 (p < 0,05) e Nm = 0,210. O locus Po-1 (FST = 0,878) teve

a maior influência no FST, e o locus Est-2 a menor (FST = 0,064). Entre as populações o FST

variou de 0,025 (Nm = 9,69) entre Patos e Campina Grande a 0,841 (Nm = 0,05) entre Barbalha e Primavera do Leste.

A distância genética de Nei (1972) entre as populações variou de 0,239 a 1,000 (Tabela 3), o dendrograma obtido pelo método neighbor-joining (Figura 2B), revelou a presença de dois grupos distintos, um formado pelas populações do Ceará e outro pelas populações da Paraíba e Primavera do Leste.

Discussão

Este trabalho representa a primeira avaliação da diversidade genética das populações brasileiras de Anthonomus grandis, a principal praga do algodão nacional. Os padrões isoenzimáticos dos seis loci utilizados foram iguais aos padrões observados por Terranova e North (1985) em colônias de A. grandis dos Estados Unidos. Os quatro loci de esterase observados por Biggers e Bancroft (1977) em A. grandis coletados em campos de

algodão no Tennessee-EUA, e por Bancroft e Jones (1977) utilizando excrementos de A.

grandis coletados em laboratório, foram observados exclusivamente na população do Mato

Grosso, sendo Est-1, Est-2 e Est-3 diagnósticos para esta população. Segundo Bartlett (1981), a diferença de atividade de loci isoenzimáticos entre populações pode indicar diferentes condições fisiológicas. Entretanto, a perda de atividade enzimática por efeitos de estocagem também pode contribuir para ocorrência destes eventos.

Os valores de H e P observados por isoenzimas no presente trabalho foram menores que os observados em outras populações de A. grandis analisadas com o mesmo marcador, com exceção das populações naturais da Carolina do Sul-EUA, que apresentaram valores de heterozigosidade e proporção de loci polimórficos inferiores, onde Ho eP foram iguais a

0,152 e 44,3%, respectivamente (TERRANOVA et al., 1991). Em relação às demais populações dos Estados Unidos e México, a heterozigosidade observada nas populações do Brasil foi cerca de duas vezes menor. Por exemplo, HO variou de 0,300 a 0,410 nas

populações de algodão cultivado do Arizona-EUA, Califórnia-EUA e México (BARTLETT et al., 1983) e de 0,322 a 0,428 em populações do Arizona-EUA (BARTLETT, 1981).

Os baixos valores de heterozigosidade (Tabela 1) são esperados em populações de insetos invasores recém-introduzidos, como o bicudo do algodoeiro, que provavelmente foi introduzido acidentalmente no Brasil. A diversidade genética das populações desta espécie, também é influenciada anualmente pelo efeito “gargalo de garrafa” ocasionado principalmente pela falta de plantas hospedeiras durante a entressafra ou à aplicação em massa de inseticida como medida de controle na cotonicultura. Os altos níveis de diversidade genética obtidos por RAPD e a presença de alelos diagnósticos entre as populações do nordeste sugerem uma grande e independente introdução no nordeste e provavelmente às populações de BARR, IPA e PL são originadas destas populações.

As populações de Barreiras e Ipameri apresentaram os menores valores de diversidade genética (Tabela 1). Estas áreas estão localizadas no cerrado brasileiro e representam à cotonicultura praticada em grande escala, onde ocorre a aplicação de grandes quantidades de inseticida químico em fazendas de monocultura geminadas, formando um extenso ambiente homogêneo propício para a proliferação do inseto apenas durante o ciclo da cultura. Porém, na entressafra a reprodução fica restrita aos poucos

refúgios presentes nas bordas (restos de cultura ou algodões em estado feral). Estes fatores são preponderantes para a manutenção desta baixa diversidade genética.

Por outro lado, as populações restantes foram coletadas em áreas onde é praticada a agricultura em pequena escala familiar. Nestas áreas de ecossistemas bastante semelhantes, há uma descontinuidade entre as regiões plantadoras, formando ilhas de cotonicultura no nordeste brasileiro. Também não existe um programa integrado visando o manejo desta praga, nem a utilização intensa de pesticidas químicos, quando comparadas ao cerrado brasileiro. A ausência de programas de controle nas áreas de agricultura familiar, associada à presença dos refúgios de bordadura, os quais alojam os indivíduos de um ano para outro, servindo como reservatório para a variabilidade genética ancestral, favorecem a manutenção de um intenso fluxo gênico entre estas populações durante todo o ano e limita a diferenciação genética entre elas.

A diferenciação genética evidenciada por RAPD (GST = 0,258; Nm = 0,72) e

isoenzimas (FST = 0,544; Nm = 0,210) revelou que as populações de A. grandis do Brasil

apresentam elevada estruturação genética. O índice de diferenciação genética duas vezes maior, observado por isoenzimas, pode ter sido influenciado pelo polimorfismo enzimático ocasionado em resposta às condições ambientais (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Os valores de diferenciação genética obtidos por RAPD revelaram que a diferenciação genética é maior entre as subpopulações (GST = 0,258) do que entre as

populações dos estados da Paraíba (PB) e Ceará (CE) onde a diferenciação genética foi moderada (GST = 0,014). Estes resultados sugerem que, como a colonização desta espécie

ocorreu relativamente em um período recente, o processo de diferenciação local pode ser bem evidenciado, entretanto, ainda não houve tempo para que os fatores evolutivos pudessem agir modificando a composição genética das populações.

Estudos com marcadores mais polimórficos (microssatélites e DNAmt) estão sendo realizados em nosso laboratório. Estes dados poderão fornecer informações mais detalhadas sobre a origem destas populações e suas rotas de dispersão do A. grandis no Brasil, com o intuito de desenvolver medidas de controle mais efetivas desta praga.

42 Referências Bibliográficas

ALFENAS, A.C.; PETERS, I.; BRUNE, W.; PASSADOR, G. C. Eletroforese de proteínas e isoenzimas de fungos e essências florestais. Viçosa, MG: UFV, 1991. p. 242. BANCROFT, H. R.; JONES, B. R. Genotypes of esterase II determined from frass of

Anthonomus grandis Boh. (Coleoptera, Curculionidae). Biochemical Genetics, v. 15, n11/12, p.1175-1179, 1977.

BARTLETT, A. C. Isozyme polymorphisms in boll weevil and Thurberia weevil from Arizona. Annals of the Entomological Society of America, v. 74, n. 4, p. 359-362, 1981. BARTLETT, A. C; RANDALL, W. C; MAY, J. E. Allozyme variation among populations of boll weevil in Arizona and Mexico. The Southwestern Entomologist, v. 8, n. 2, p.118- 130, 1983.

BELKHIR, K.; BORSA, P.; CHIKHI, L.; RAUFASTE, N.; BONHOMME, F. GENETIX 4.02: Logiciel sous windows TM pour la génétique des populations. laboratoire génome, populations, interactions, CNRSUMR 5000, Montpellier: University of Montpellier II, 2001.

BIGGERS, C. J.; BANCROFT, H. R. Esterase of laboratory-reared and field-collected cotton boll weevil, Anthonomus grandis Boh.: polymorphism of adult esterases and formal genetics of esterase II. Biochemical Genetics, v.15, n. 3/4, p. 227-233, 1977.

BURKE, H. R.; CLARK, W. E.; CATE, J. R.; FRYXELL. P.A. Origin and dispersal of the boll weevil. Bull Entomology Society of America, v. 32, p. 228-238, 1986.

FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3. ed. Brasília: Embrapa-CENARGEN, 1998. 200 p (Embrapa-CENARGEN Documento 20).

GOUDET, J. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3). Disponível em: <http://www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html > 2001.

KIM, K. S.; SAPPINGTON, T. W. Boll weevil (Anthonomus grandis Boheman) (Coleoptera: Curculionidae) dispersal in the southern United States: evidence from mitochondrial DNA variation. Molecular Ecology and Evolution, v. 33, p. 457-470, 2004a.

KIM, K. S.; SAPPINGTON, T. W. Genetic structuring of boll weevil populations in the US based on RAPD markers. Insect Molecular Biology, v. 13, p. 293-303, 2004b.

KUMAR, S.; TAMURA, K.; NEI, M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, v.5, p.150-163, 2004.

LOZADA, R. M. M.; ALVAREZ, L. A.; WHITCOMB, W. H. El picudo mejicano del algodonero, Anthonomus grandis Boh: el desafio para la producción algodonera en el Paraguay. Paraguay: Publication Miscelanea, 1987. 94 p.

MCDERMOTT, J. M.; MCDONALD, B. A. Gene flow in plant pathosystems. Annual Review of Phytopathology, v. 31, p. 353-373, 1993.

MILLER, M. P. Tools for populations genetic analyses (TFPGA) 1.3. A windows program for analysis of allozyme and molecular populations genetic data. Computer software distributed by authors. 1997.

NEI, M. Genetic distance between populations. American Naturalist, v. 106, p. 283-292, 1972.

OOSTERHOUT, C. V.; HEUVEN, M. K. V.; BRAKEFIELD, P. M. On the neutrality of molecular genetic markers: pedigree analysis of genetic variations in fragmented populations. Molecular Ecology, v. 13, p. 1025-1034, 2004.

ROEHRDANZ, R. L.; NORTH. D. T. Mitochondrial DNA restriction fragment variation and biosystematics of the boll weevil, Anthonomus grandis. Southwestern Entomologist, vol. 17, n. 2, p.101-108, 1992.

ROEHRDANZ, R. L. Genetic differentiation of southeastern boll weevil and Thurberia weevil Populations of Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae) using Mitochondrial DNA. Genetics, v.94, n.6, p.928-935, 2001.

SCATAGLINI, M. A.; CONFALONIERI, V. A.; LANTERI, A. A. Dispersal of the cotton boll weevil (coleoptera: Curculionidae) in South America: evidence of RAPD analysis. Genetica, v. 108, p. 127-136, 2000.

TABACHNICK, W. J. A world-wide survey of genetic variation in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Genetic Researcher, v. 34, p. 215-229, 1979.

TERRANOVA, A. C.; JONES, R. G.; BARTLETT, A. C. An allozyme study of the laboratory boll weevil and its influence on some southeastern populations. Southwestern Entomologist, v. 16, n. 1, p. 1-11, 1991.

TERRANOVA, A. C.; NORTH, D. T. Inheritance of allozyme in the boll weevil (Coleoptera: Curculionidae). Annals of the Entomological Society of America, v.78, n.2, p.166-171, 1985.

WEIR, B. S.; COCKERHAM, C. C. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution, v. 38, p. 1358-1370, 1984.

YEH, F. C.; BOYLE, T. J. B. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits. Belgian Journal of Botany, v. 129, p. 157, 1997.

Figura 1: Mapa do Brasil mostrando os pontos de coleta de Anthonomus grandis. As localidades estão listadas na Tabela 1 (CG = Campina Grande; PT = Patos; BARB = Barbalha; MV = Missão Velha; BARR = Barreiras; PL = Primavera do Leste e IPA = Ipameri).

Figura 2: Dendrogramas construídos pelo método neighbor-joining. A: obtido por RAPD; B: obtido por isoenzimas. As populações estão listadas na Tabela 1.

Campina Grande Patos Primavera do Leste Barbalha Missão Velha 0.0 0.2 0.4 Barreiras Ipameri Campina Grande Patos Barbalha Missão Velha 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

A

B

46 RAPD Isoenzimas Região Localidade/Sigla N HO P (%) N HO P(%) Campina Grande (CG) 30 0,261 68 50 0,224 100 Nordeste Patos (PT) 24 0,275 68 46 0,174 50 Barbalha (BARB) 28 0,301 72 46 0,205 25 Missão Velha (MV) 30 0,347 84 46 0,184 66,6 Barreiras (BARR) 15 0,203 60 - - -

Centro- Oeste Primavera do Leste (PL) - - - 46 0,277 100

Ipameri (IPA) 15 0,189 52 - - - Média 23.6 0.262 67.3 46.8 0.212 68.3 1 2 3 4 5 6 1. Campina Grande **** 0.238 0.553 0.302 0.367 0.297 2. Patos 157.5 **** 0.411 0.243 0.198 0.264 3. Barbalha 0375 230 **** 0.180 0.479 0.716 4. Missão velha 0205 2125 0020 **** 0.454 0.477 5. Barreiras 1015 1020 0830 0850 **** 0.209 6. Ipameri 1785 1730 1515 1535 0720 **** 1 2 3 4 5 1. Campina grande **** 0.239 1.000 1.000 0.756 2. Patos 1575 **** 1.000 0.632 1.000 3. Barbalha 0375 0230 **** 0.646 1.00 4. Missão Velha 0205 2125 0020 **** 0.590 5. Primavera do Leste 2085 2100 1885 1905 ****

Tabela 1: Análise da diversidade genética de populações de Anthonomus grandis, por localidade, número de indivíduos analisados (N) e medidas de variabilidade genética: heterozigosidade observada (H0) e porcentagem de loci polimórficos (P) obtidas por

isoenzimas e RAPD.

Tabela 2: Distância genética de Nei (1972) obtida por RAPD (diagonal superior) e distância geográfica (km) entre as populações (diagonal inferior) de Anthonomus grandis coletadas no Brasil.

Tabela 3: Distância genética de Nei (1972) revelada por isoenzimas (diagonal superior) e

No documento Diversidade genética de populações naturais de Anthonomus grandis Boheman (Coleoptera : Curculionidae) (páginas 44-86)