As proteínas foram expressas e purificadas enoveladas

Os cDNAs das proteínas Rvb1 e Rvb2 foram clonados em vetores de expressão do sistema pET, pET15b e pET28a, respectivamente, adquiridos comercialmente. Como esse sistema está sob controle de um promotor forte do bacteriófago T7 e ocorre na presença de uma RNA polimerase altamente seletiva, quando completamente induzido, quase todo recurso da célula é dirigido para a expressão gênica do cDNA alvo e o produto gênico pode chegar a mais que 50% do conteúdo proteico celular, isso em poucas horas após a indução (pET system manual, Novagen 2003). Outra vantagem, é que esse sistema também permite o controle dos níveis de expressão por concentração de indutor ou temperatura para melhorar o rendimento solúvel de proteínas alvo, como foi o caso das proteínas Rvb1 e Rvb2, que teve a expressão na fração solúvel melhorada em baixas temperaturas e com rendimento satisfatório (figuras 21 e 26).

Uma vez que se obteve uma boa expressão das proteínas, seguiu-se para a etapa de purificação através dos métodos de cromatografia de afinidade. As proteínas fusionadas à cauda de hexa-histidina ligam na resina de afinidade a metal, esta afinidade é resultante de ligações de coordenação reversíveis formadas entre um íon metálico quelatado e o imidazol dos resíduos de histidina, os quais doam elétrons para o íon metálico (Bresolin et al., 2009). Com esta técnica foi possível isolar grande parte dos contaminantes advindos da E. coli.

A separação da proteína de interesse de proteínas indesejadas foi realizada com sucesso pela cromatografia de exclusão molecular. Esse método cromatográfico é baseado na separação de moléculas de acordo com o tamanho e forma. A coluna cromatográfica contém um polímero com poros de tamanhos definidos, assim moléculas menores penetram nos poros da resina percorrendo uma caminho maior e levando mais tempo para serem eluídas e as moléculas maiores por não entrarem nos poros eluem mais rapidamente, isso ocorre sob um fluxo contínuo de solvente (Voet, 2006; Amersham Bioscience, 2002). A Rvb1 apresentou dois picos com volumes de eluição diferentes, mostrando que há formação de agregado e que este foi separado da amostra a qual foi utilizada nos experimentos. A Rvb2 por outro lado, apresentou um único volume de retenção de 140 mL, próximo da região de eluição de agregados, indicando ser um

oligômero. O grau de pureza foi monitorado por SDS-PAGE e com a execução deste protocolo de purificação, a pureza alcançada para Rvb1 e Rvb2 foi considerada satisfatória para a realização dos estudos bioquímicos e biofísicos.

Os protocolos encontrados na literatura para a purificação da Rvb1 e Rvb2 de humano e S. cerevisiae variam de acordo com a análise e técnicas a serem realizadas, mas na maioria os tampões utilizados contém NaCl ou KCl em altas concentrações, em alguns casos também se fez o uso de glicerol. Muitas vezes, a fim de estabilizar interações intermoleculares são utilizados aditivos, por exemplo, glicerol, arginina e outros aditivos químicos. E, também se faz uso do aumento da concentração de sais neutros, que auxiliam na solubilização e prevenção de agregação das proteínas nativas (Bondos & Bicknell, 2003; Fink, 1998), o que foi necessário para a purificação das Rvbs, já que estas proteínas apresentam tendência a formação de agregados.

Uma análise de desnaturação térmica foi feita através de experimentos de DSF a fim de determinar as melhores condições tamponantes para cada proteína. Neste experimento, conforme a proteína é desnaturada pelo aumento da temperatura, suas regiões hidrofóbicas são expostas e ocorre a interação com a sonda fluorescente, sendo possível observar a emissão de fluorescência (Senisterra et al., 2011). A proteína Rvb1, apresentou uma variação considerável de Tm conforme a diminuição da concentração de NaCl na solução tampão. Sendo a maior Tm obtida em tampão Tris-HCl 25 mM pH 8 NaCl 50 mM (Tm=63,3 0C). Em tampão Tris-HCl 25 mM pH 8 NaCl 200 mM a Tm foi de 55,9 0C, sendo 3,5 0C a mais que a Tm em tampão Tris-HCl 25 mM pH 8 NaCl 500 mM. Isso indica que a proteína tem uma estabilidade maior em baixas concentrações salinas, no entanto, o tampão de escolha foi Tris-HCl 25 mM H8 NaCl 500 mM, pois seria o tampão ideal para trabalhar na formação do complexo Rvb1/Rvb2. Isso, porque a Rvb2 apesar de não ter apresentado resultados satisfatórios nos experimentos de DSF, demonstrou ser uma proteína instável em tampões Tris-HCl pH 8 com baixas concentrações de NaCl, precipitando em diálise e mostrando um perfil de degradação (dados não apresentados). Outro motivo para trabalhar com essas proteínas em tampão Tris-HCl e não fosfato foram os experimentos para análise funcional das proteínas através de ensaios de atividade ATPase, onde é medido a atividade ATPásica das proteínas através do Pi na reação da proteína em presença de ATP em função do tempo. Na presença de alguns tampões não foi possível determinar a Tm da proteína, isso poderia ser explicado por uma precipitação, indicando instabilidade da proteína nessas condições.

A técnica de dicroísmo circular permitiu verificar a estrutura secundária das proteínas através da análise de sinais característicos nos espectros. O espectro de uma proteína contendo majoritariamente hélice α apresenta mínimos em 208 e 222 nm e de um proteína contendo majoritariamente folha-β apresenta um mínimo entre 210 e 220 nm (Côrrea & Ramos, 2009). Os espectros de dicroísmo circular no UV distante de Rvb1 e Rvb2 purificadas e sem DNA mostrou-se compatível com o espectro de uma proteína enovelada e predominantemente hélice α. Não foram encontrados resultados de dicroísmo circular para estas proteínas na literatura, mas em 2006, Matias et al. mostrou através da estrutura cristalina da Rvb1 humana, que esta proteína é uma molécula hexamérica, onde cada monômero aparece complexado com uma molécula de ADP e é constituído por 14 hélice α e 16 folha β.

O experimento de desenovelamento térmico monitorado por CD revelou que nas condições estudadas foi irreversível tanto para Rvb1, quanto para Rvb2, uma vez que o sinal de CD a 222 nm não foi recuperado mesmo com diminuição da temperatura. A temperatura no ponto médio de transição do estado nativo para o estado desenovelado para Rvb1 foi de 61 0C em tampão TN500 e teve uma pequena variação com a mudança na força iônica do meio, sendo de 64 0C em meio com 300 mM de NaCl e de 63 0C com 200 mM de NaCl, indicando que mudanças na força iônica não provocam grandes alterações na estabilidade térmica da proteína nessas condições. Esse resultado correlaciona com o resultado de DSF que também mostrou aumento na Tm da proteína em meio com menor concentração de sal. Houve uma diferença de quase 10 0C quando se compara os valores de Tm obtidos por desenovelamento térmico monitorado por CD e os obtidos por DSF, no entanto deve-se considerar que são técnicas diferentes.

O desenovelamento térmico da Rvb2 monitorado por CD a 222 nm mostrou que a força iônica interfere na estabilidade da proteína, uma vez que a diferença de Tm foi de 7 0C maior na troca de tampão Tris-HCl 25 mM pH 8 NaCl 500 mM para fosfato 25 mM pH 8 NaCl 300 mM, mas como já mencionado anteriormente, por ser uma ATPase e devido os experimentos de atividade ATPase, o tampão de escolha foi Tris-HCl 25 mM pH 8 NaCl 500 mM.

A emissão de fluorescência estática do triptofano nos permite dizer se os resíduos de triptofano estão expostos a um ambiente polar ou enterrados em regiões hidrofóbicas. Quando se tem emissão de fluorescência próxima a 350 nm, os resíduos de triptofano encontram-se expostos ao solvente, quando emitem flurescência < 330 nm, estão enterrados em regiões hidrofóbicas de uma proteína (Millar, 1996).

Ficou demonstrado que o máximo de emissão de fluorescência observado para Rvb2 foi de 335nm, uma emissão de fluorescência intermediária, sugerindo que os dois triptofanos presentes na sequência primária da proteína encontram-se parcialmente em um ambiente apolar ou que um dos tiptofanos está exposto ao ambiente polar enquanto o outro encontra-se em uma região bem enovelada da proteína.

Na literatura, existem contradições em relação às estruturas das Rvbs entre diferentes ou a partir de uma mesma espécie, e isso pode ser atribuído por diferentes métodos de purificação e condições de tampão ou devido a múltiplos estados funcionais relevantes fisiológicamente (Ortega et al., 2010; Torreira et al., 2008; Gribun et al., 2008; Puri et al., 2007; Dutta&Jha, 2009). Nesse trabalho, os experimentos de gel filtração analítica revelaram que a Rvb2 apresenta um raio hidrodinâmico equivalente a 82 ± 1 Å e a proteína Rvb1 um raio de 54±1 Å.

A estrutura cristalina da Rvb1 humana mostrou dimensões de 75 x 55 x 45 Å para cada monômero da molécula hexamérica (Matias et al., 2006) e que esta se complexa com Rvb2 em complexo composto por dois anéis hexaméricos com um diâmetro máximo de 158 Å (Puri et al., 2007). Gribun et al., 2008 mostrou por microscopia eletrônica que o complexo hexamérico formado por Rvb1/Rvb2 apresenta mudanças de conformação quando na presença de diferentes nucleotídeos, nas presença de ADP as partículas forma um hexágono com 142 Å entre vértices opostos e na presença de ATP ou ATPS essa distância é de 152 Å.

Nossos resultados de cromatografia de exclusão molecular e gel filtração analítica, também demonstram que essas proteínas são grandes oligômeros e apesar de apresentarem 43% de indentidade, Rvb1 apresentou duas formas, com formação de agregado e Rvb2 sendo como uma molécula maior que Rvb1. Rvb2 humana na presença de nucleotídeo (ATP ou ADP) e MgCl2 em cromatografia de exclusão molecular teve eluição em pico correspondente a massa molecular de 400 KDa, mais do que era esperado para a massa a um hexamero (320 KDa), contraditoriamente Rvb1 eluiu como um monômero nas mesmas condições (Puri et al., 2007).

As proteínas isoladas se mostraram susceptiveis a formação de oligômeros tanto em alta (40 μM) quanto em baixas concentrações (5 μM) (Gribun et al., 2008) e a cauda de histidina influencia no estado oligomérico das proteínas. Foi relatado também que quando misturadas para formação de complexo são observadas diversas estequiometrias de hexâmeros de Rvb1:Rvb2, além disso Rvb1 e Rvb2 podem formar dímeros, trímeros e hexâmeros estáveis. Diferenças na formação de oligômeros estáveis entre Rvb1 e Rvb2 humana para formação do complexo, podem indicar que Rvb2 inicialmente forma um anel hexamérico que promove a hexamerização de

Rvb1 para finalmente forma um duplo-anel hexamérico (Puri et al., 2007; Ortega et al., 2010; Tsaneva, 2010). Contudo, a relevância dessas diferenças nas formas das Rvbs, fisiológicamente, ainda não foi esclarecida. (Torreira et al., 2008; Tsaneva, 2010).