Aspectos Éticos

Conforme determina a Resolução 196/96 o Conselho Nacional de Saúde, este estudo foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa (CEP/UFJF) e aprovado sob o parecer n°. 250/2009 (Apêndice A). Após conscientizados de sua participação no estudo, todos os envolvidos assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice B).

4.2 Materiais

MATERIAL FABRICANTE

Luvas descartáveis Lemgruber Ind. Frontenense de látex S/A Paulo

de Frontin, Rio de Janeiro/RJ, Brasil.

Potes estéreis Hos d Far Prod. Farmacêuticos e Hospitalares

Ltda., Ubá/MG, Brasil.

Seringa descartável estéril 5Ml Embramac – Empresa Bras. Materiais cirúrgicos,

Campinas/SP, Brasil.

Vacutainer estéril BD Diagnostics – Lab. Hermes Pardini, São

Paulo/SP, Brasil.

Caixa de isopor -

Cloreto de sódio a 0,9% estéril – solução eletrolítica injetável

Laboratório Sanobiol Ltda., Pouso Alegre/MG, Brasil.

Cloreto de sódio a 0,9% Laboratório Farmacêutico Arboreto Ltda., Juiz de

Fora/MG, Brasil.

Solução aquosa de clorexidina a 0,12% Bella Farma Farmácia de Manipulação,

Cataguases/MG, Brasil.

Jogo de moldeiras de estoque Vernes, Tecnodent Ind. Com. Ltda., São

Paulo/SP, Brasil.

Hidrocolóide irreversível Lote 343 08 Ezact Kromm, Vigodent SA Indústria e Comércio,

Rio de Janeiro/RJ, Brasil.

Placas CHROMagar Orientation Probac Brasil Prod. Bacteriológicos Ltda., São

Paulo/SP, Brasil. Alças calibradas de 1µL estéreis

Distribuidora Paranhos Artigos

para Laboratórios Ltda., Belo Horizonte/MG, Brasil.

Microcentrífuga Bio Eng Mod 4000 Brushless série 1549

Spectrun Bio Engenharia Médica Hospitalar, São Paulo/SP, Brasil

Estufa Magnus nº 11-2001 Ind. Comércio de Fornos Magnus Ltda., Belo

Horizonte/MG, Brasil.

4.3 Métodos

Foram selecionados 21 pacientes, de ambos os sexos, (com idade entre 19 e 85 anos), identificados por números, tendo como critérios de inclusão: dentição permanente com no mínimo seis dentes e como critério de exclusão o uso de antibióticos nos últimos trinta dias.

Os pacientes selecionados foram divididos aleatoriamente em dois grupos: G1 grupo controle = pacientes 01, 03, 05, 07, 09, 11, 13, 15, 17 e 19 (n = 10) identificados na cor vermelha. Os do G2 grupo experimental = pacientes 02, 04, 06, 08, 10, 12, 14, 16, 18, 20 e 21 (n = 11) identificados na cor azul. Em ambos os grupos foi aplicado um questionário para obtenção dos dados demográficos (Anexo C).

Nos dois grupos, a primeira coleta de saliva não estimulada, aquela secreção salivar sempre presente, produzida continuamente por estímulos gustativos e mastigatórios sem utilização de estímulos artificiais como pedaços de parafina ou látex, foi feita em potes estéreis (Fotografia 1).

Fotografia 1 – Potes estéreis para coleta da saliva inicial. G1 controle = vermelho; G2 experimental = azul.

No grupo controle G1, os pacientes fizeram bochecho com 15mL de solução fisiológica (cloreto de sódio a 0,9%, Laboratório Farmacêutico Arboreto Ltda., Juiz de Fora/MG, Brasil), por 01min. A segunda coleta de saliva do G1 foi realizada 05min. após o bochecho. No grupo experimental G2, os pacientes fizeram bochecho com 15mL de solução aquosa de digluconato de clorexidina a 0,12% fabricada pela Bella Farma Farmácia de Manipulação, Cataguases/MG, Brasil, também por 1min. A segunda coleta de saliva do G2 foi realizada 05min. após o bochecho (Fotografia 2).

Fotografia 2 – Potes estéreis para coleta da saliva pós-bochecho. G1 controle = vermelho; G2 experimental = azul.

Após estes procedimentos procedeu-se a moldagem em todos os pacientes de ambos os grupos. Para tanto, nos dois grupos, utilizou-se moldeiras de estoque (Vernes, Tecnodent Ind. Com. Ltda., São Paulo, Brasil) para arcada inferior por ser a área de maior concentração de saliva. O hidrocoloide irreversível (Alginato, Ezact Kromm, Vigodent SA Indústria e Comércio, Rio de Janeiro/RJ, Brasil) foi o material de escolha para as moldagens, por não conter clorexidina em sua composição. A técnica de moldagem obedeceu às normas de manipulação na proporção água/pó recomendada pelo fabricante (ZUIM et al., 2003). Após sua remoção da cavidade bucal, a moldagem foi lavada usando seringa descartável estéril com 5mL de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% (solução eletrolítica

Fotografia 3 – Procedimento de lavagem da moldagem com seringa de 5mL descartável e soro estéril.

O líquido proveniente da lavagem da moldagem escoava para um pote estéril próprio para este fim. Em seguida, coletou-se deste pote por aspiração a solução e com a mesma lavou-se novamente a moldagem e esta solução foi inserida em vacutainer estéril. Os potes com as soluções coletadas foram armazenados em uma caixa de isopor com gelo (Fotografia 4), sob refrigeração encaminhada ao Laboratório Oswaldo Cruz (Cataguases/MG).

Fotografia 4 – Material acondicionado para envio ao laboratório para análise microbiológica.

Os vacutainers foram levados em uma microcentrífuga (Bio Eng Mod 4000 Brushless série 1549) por 10min. a 3500rpm (Fotografia 5). Somente o concentrado foi usado para semeadura, sendo desprezado o excesso não decantado.

Fotografia 5 – Microcentrífuga com velocidade de 3500rpm utilizada por 10min. para decantação da saliva obtida pós-lavagem da moldagem.

As salivas coletadas foram semeadas em um meio de cultura para análise microbiológica em placas CHROMagar Orientation (Probac Brasil Prod. Bacteriológicos Ltda., Sao Paulo/SP, Brasil), em procedimento já validado na literatura (CHANG et al., 2008; HOUANG et al., 1999; MERLINO et al., 1996; SAMRA et al., 1998; SCARPARO et al., 2002) utilizando-se alças calibradas estéreis (Distribuidora Paranhos Artigos para Laboratórios Ltda., Belo Horizonte/MG, Brasil.) de 1L pela técnica de esgotamento de alça (Fotografia 6) (AFESSA et al., 2006; BASELSKI et al., 1992; TORTORA; FUNKE; CASE, 2005) e deixadas em estufa (Magnus n°. 11-2001) com temperatura controlada em 37ºC por um período de 24h (BAMBACE, 2003; CASEMIRO et al., 2007; COTRIM, SANTOS; JORGE, 2001; ESTEVES et al., 2007; ESTRELA et al., 2003; FLANAGAN et al., 1998; MEMARIAN

et al., 2007; MOREIRA; CRUZ, 2005; TRABULSI; TOLEDO; GOMES, 2008; SANTOS; JORGE, 2001; TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).

Durante a execução de todo o experimento manteve-se uma cadeia asséptica na manipulação dos materiais.

Fotografia 6 – Semeadura em meio de cultura utilizando a técnica da Alça Calibrada.

Decorridas 24h, procedeu-se a contagem das UFC dos grupos controle e experimental (Fotografias 7 e 8). Seguindo as instruções do fabricante do CHROMagar Orientation, foi determinado, previamente , que as colônias sugestivas de cocos Gram-positivos (Streptococcus sp. do grupo viridans) seriam colônias bem pequenas, puntiformes, identificadas na cor azul turquesa, enquanto que as colônias sugestivas de cocos Gram-positivos (Staphylococcus sp.) ou bastonetes Gram- negativos (Neisseria sp.), seriam também pequenas ou médias, identificadas na cor creme claro, opaca. Colônias sugestivas de bastonetes Gram-negativos (Enterobacteriaceae) seriam grandes (maior diâmetro), identificadas na cor azul marinho brilhante.

Fotografia 7 – Contagem das unidades formadoras de colônias no grupo controle: A) inicial; B) após bochecho com soro fisiológico; C) pós-moldagem.

Fotografia 8 – Contagem das unidades formadoras de colônias no grupo experimental: A) inicial; B) após bochecho com clorexidina a 0,12%; C) pós-moldagem.

Conforme preconiza a técnica do esgotamento por alça calibrada, a contagem das UFC se deu na área três de cada placa (Fotografia 9), que foi realizada com a utilização de lupa e em ambiente laboratorial por um único operador. Considerando-se a alça calibrada de 0,001mL utilizada após a contagem da UFC foi adotada a seguinte fórmula: n°. de colônias x 10³ = UFC/mL, de acordo com o preconizado na literatura. Para a análise dos dados obtidos, em termos de UFC/mL, os valores foram plotados em escala logarítmica, usando-se log10 (COUSIDO et al., 2008; TOMÁS et al., 2008).

Fotografia 9 – A e B) estrias provocadas pela alça calibrada a 0,1µL sobre placa de Petri contendo CHROMagar Orientation® na técnica de esgotamento de alça; C) destaque da área utilizada para contagem das unidades formadoras de colônias em ambos os grupos.

A B C

A B C