Aspectos gerais sobre Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces marxianus

O processo de conversão de açúcares a etanol, pela levedura

sistema batelada. Os principais produtos secundários produzidos durante a fermentação alcóolica são; glicerol, biomassa celular e ácido succínico, entretanto, outros ácido orgânicos podem ser produzidos como o ácido acético, benzóico e octanóico (Taherzadeh et al., 1997). Segundo Kuyper et al. (2005), a S. cerevisiae é o principal micro-organismo utilizado na produção industrial de etanol em grande escala.

Devido à alta produtividade em etanol, há décadas vêm-se estudando diferentes aspectos metabólicos, fisiológicos, genéticos e industriais da levedura S. cerevisiae a fim de se conhecer melhor este micro-organismos e aumentar as conversões em etanol. Segundo Van Dijken et al. (2000) muitos aspectos são favoráveis para se realizar estudos com a S.

cerevisiae como; crescimento rápido em meio mineral definido sem necessidade de

suplementos vitamínicos, ampla gama de fontes de carbono e nitrogênio para o crescimento; alto rendimento de biomassa em fontes de carbono, rápido crescimento aeróbio em cultivo contínuo com limitação de glicose, crescimento em meio definido sob condições estritamente anaeróbias, alta eficiência de esporulação, viabilidade dos esporos, eficiência de manutenção fisiológica, alta eficiência de transformação, geneticamente estáveis e boa produção de proteínas heterólogas, tanto intra e extracelular.

Taherzadeh et al. (1997) estudaram o aspecto toxicológico do ácido acético na produção de etanol pela levedura S. cerevisiae. A toxicidade do ácido acético, assim como outros ácidos orgânicos fracos é dependente do valor de pH, intra e extracelular, uma vez que a molécula não-dissociada pode atravessar a parede celular microbiana (Gottschalk, 1987). Segundo Verduyn et al. (1990), a adição de ácido acético ao meio de crescimento celular em cultivo anaeróbio contínuo pode desfavorecer o rendimento em biomassa celular e favorecer a produção de etanol, e a explicação está relacionada com os mecanismos de transporte passivo (difusivo) do ácido acético não-dissociado para o interior da célula e o mecanismo de transporte ativo do ácido acético na forma dissociada para o exterior da célula onde há o consumo de ATP.

Taherzadeh et al. (2000) estudaram os efeitos fisiológicos do furfural no crescimento da S. cerevisiae na presença de etanol e acetato como fonte de carbono e energia e observaram uma inibição no crescimento celular nos dois casos estudados. Entretanto quando todo furfural foi convertido em furfuril álcool e ácido furóico, o crescimento celular foi retomado. Bowman et al. (2010) estudaram a estequiometria da redução do furfural pela enzima aldeído redutase em culturas de S. cerevisiae e, a partir de um modelo de Michaelis pôde-se observar resíduos hidrófobos próximo do local de ligação do furfural, e que, mediante a mutação, pôde- se aumentar a especificidade para o furfural e melhorar o desempenho da enzima. Jordan et al. (2011) estudaram, além do furfural, a toxicidade do 5-hidroximetilfurfural em culturas de S.

cerevisiae fazendo uma analises da ação de enzima aldeído redutase, bem como a elaboração

de uma modelo do processo. Moon & Liu (2012) a partir de estudos de engenharia genética, tentaram produzir leveduras mais tolerantes aos inibidores furfural e 5-hidroximetilfurfural e

apresentaram resultados promissores. Kuyper et al. (2005) aplicaram princípios de engenharia evolutiva em culturas de S. cerevisiae mutantes para a utilização de xilose como fonte de carbono e energia pela levedura e concluiu que o uso de xilose para produção de etanol não é mais um gargalo quando se pensa em produção de etanol de segunda geração. O termo etanol de segunda geração é utilizado quando se usa material lignocelulosico como matéria-prima pra produção de etanol, uma abordagem mais detalhada deste tema será descrita no tópico sobre biorrefinaria.

Wang & Hatzimanikatis, (2006) desenvolveram uma estrutura computacional e matemática utilizando o método de Monte Carlo em que a incerteza dos parâmetros pode ser resolvida através de um procedimento de amostragem em larga escala. Esta estrutura foi aplicada nas compartimentadas rotas de carbono do metabolismo da levedura S cerevisiae considerando os processos batelada e contínuo e a integração de informações a partir da análise de fluxo metabólico. A análise estatística dos resultados indica que as células de levedura crescendo em diferentes condição de cultura (batelada e contínuo) apresentam comportamentos distintos.

Basso et al. (2008) apresentaram um programa de seleção de leveduras realizado durante 12 anos com o objetivo de selecionar espécies de leveduras S. cerevisiae adequadas para a fermentação de substratos de cana-de-açúcar (caldo de cana e melaço), com reciclo de células, como é realizado em usinas brasileiras de etanol. Como resultado, algumas provas foram apresentadas, mostrando o impacto positivo das cepas de leveduras selecionadas no aumento da produção de etanol e redução dos custos de produção devido ao seu maior desempenho de fermentação (alta produção de etanol, redução de glicerol produzido e formação de espuma, manutenção da alta viabilidade durante a reciclagem e a alta capacidade de utilização em fermentadores industriais). Os resultados também sugerem que a grande biodiversidade de leveduras encontradas em ambientes de destilaria pode ser uma importante fonte de cepas produtoras de etanol. Isso ocorre porque durante a reciclagem das células, a pressão seletiva (uma evolução adaptativa) é imposta sobre as células, levando-as a uma maior tolerância às condições estressantes da fermentação industrial. Os resultados, também, provaram que as leveduras PE-2, CAT-1 e BG-1 apresentaram uma notável capacidade de competir com leveduras selvagens, sobreviver e dominar as fermentações industriais, e são, atualmente, as cepas mais utilizadas nas usinas de etanol no Brasil. Dorta et al. (2006) estudaram duas linhagens de S. cerevisiae, PE-2 e M-26, quanto ao potencial de fermentação alcoólica em condições altamente estressantes proporcionadas pela presença de sulfito, ácido

lático, etanol e baixo pH. O pH baixo (3,6) foi o principal fator de estresse nas leveduras, durante a fermentação. A cepa M-26 produziu maior acidez do que a outra cepa, com uma maior produção de ácido succínico, um importante inibidor de bactérias lácticas. Ambas as linhagens de leveduras mostraram desempenho semelhante durante a fermentação, não havendo diferença significativa na viabilidade celular.

A Kluyveromyces marxianus foi descrita pela primeira vez em 1888 por E. C. Hansen onde, naquela época, seu nome era Saccharomyces marxianus após Marx ter, originalmente, isolado uma cepa proveniente de uvas (Fonseca et al., 2008). É uma levedura hemiascomicetos homotalica usualmente encontrada em produtos lácteos, entretanto, também é encontrada em diferentes habitats, sendo capaz de crescer na presença de inulina. Esta espécie está apta a crescer em temperaturas elevadas como 45 °C, possui alta capacidade de conversão de biomassa e uma alta taxa específica de crescimento entre os eucariotos. Apresenta dimorfismo assim como as leveduras S. cerevisiae e Wickerhamomyces anomalus, sendo a morfologia de algumas cepas como a K. marxianus CBS 397, afetada pela taxa de crescimento. Esta é uma característica interessante para se estudar a produção e excreção de proteínas, uma vez que células filamentosas são conhecidas por ter uma melhor secreção de proteínas do que as células com crescimento leveduriforme (Rocha et al., 2011a).

Desde de que Van de Walt, (1956) propôs o gênero de leveduras Kluyveromyces, vários trabalhos reportaram aspectos taxonômicos de espécies e variedades entre este gênero aplicando diferentes abordagens e técnicas. Um aspecto comum que foi observado recentemente nos trabalhos foi uma alta heterogeneidade entre membros do mesmo gênero (Rocha et al., 2011b).

O gênero Kluyveromyces é restrito a seis espécies de acordo com a classificação monofiletica geral baseada na sequência do rDNA 26S. Duas espécies, K. lactis e K.

marxianus carregam o gene par LAC12-LAC4 que forma e subsequente cliva a lactose em

galactose e glicose, sendo as duas linhagens, lactose positivas. K. lactis foi escolhida como modelo para análises genéticas de leveduras lactose positivas e tem sido extensamente estudada a nível molecular. Já a levedura K. marxianus é menos estudada a nível molecular, mas tem sido adotada industrialmente para aplicações de aproveitamento de biomassa e processos de biorremediação. As vantagens destas leveduras são o rápido crescimento celular, secretar enzimas inulinases, produzir etanol e ser termotolerante. Entretanto, não existem, ainda, dados na literatura que explique a termotolerância deste levedura (Lane et al., 2011). K.

marxianus é, também, conhecida por consumir xilose como fonte de carbono (Rocha et al.,

2011b).

Diferentes cepas de K. marxianus têm sido isoladas de diferentes habitats sugerindo uma alta diversidade metabólica e um substancial grau de polimorfismo intraespecífico. Como consequência, diferentes aplicações biotecnológicas têm sido estudadas usando esta levedura como; produção de enzimas (β-galactosidase, β-glicosidase, inulinase, polygalacturonases, dentre outras), single-cell protein, produção de compostos aromáticos e etanol, redução de lactose em alimentos, expressão de proteínas heterologas, bem como aplicações em biorremediação e medicina (Rocha et al., 2011b).

Grba et al. (2002) estudaram cinco cepas de K. marxianus para produção de etanol a partir de soro de leite desproteinado variando diferentes condições de temperatura e concentração inicial de lactose. Os resultados apontaram que as linhagens K. marxianus VST 44 e ZIM 75 são capazes de produzir etanol, bem como biomassa celular a partir do substrato utilizado. Christensen et al. (2011) estudaram a produção de etanol a partir de soro do leite produzido na produção de queijo orgânico. A partir dos resultados, foi visto que não foi preciso pasteurizar nem resfriar o coproduto, e a levedura K. marxianus foi capaz de competir com as bactérias láticas utilizadas na fabricação dos queijos produzindo etanol desde que uma significante quantidade de ácido lático não fosse produzida (1 a 2 g/L). Parrondo et al. (2009) estudaram a suplementação de extrato de levedura, sulfato de amônia, proteínas, peptídeos, vitaminas como ácido nicotínico, biotina, ácido pantotenico e inositol no soro de leite para a produção de etanol em um cultivo aeróbio onde os autores, também, consideraram o efeito

Crabtree-negative em seus estudos. Os resultados apontaram que a adição de extrato de

levedura bem como algumas vitaminas direcionaram o processo para o metabolismo fermentativo, favorecendo a produção de etanol. Diferentes modelos cinéticos estão sendo desenvolvidos no estudo de produção de etanol utilizando a levedura K. marxianus e o substrato soro de leite como fonte de carbono e energia (Longhi et al., 2004; Ozmihci & Kargi, 2007; Sansonetti et al., 2011).

Outra matéria-prima que pode ser usada para produção de etanol é a biomassa vegetal, rica em celulose, hemicelulose e lignina onde a celulose e hemicelulose são polímeros de açúcares utilizados pala levedura K. marxianus como fonte de carbono e energia, os principais são glicose e xilose (Suryawati et al. 2009; Rocha et al., 2011b).