Esquema 2.6 Reacção efectuada para obtenção do ácido artesúnico Reagentes e condições:
2.16. Assim, têm-se dois derivados com a função ácida, para o acoplamento à
dipeptidilvinilsulfona, originando os compostos híbridos finais, 2.19 e 2.20. De acordo com a literatura e com os resultados anteriores, a sequência ideal de aminoácidos é a que contém a Leu-hPh ligada à unidade vinilsulfona, pelo que estes derivados foram sintetizados contendo esta unidade dipeptídica.
N H O N H S O O O O O O O O O n 2.19, n = 2 2.20, n = 3 2.2.2 - Caracterização estrutural
2.2.2.1 - Ressonância Magnética Nuclear
Em relação à unidade da dipeptidilvinilsulfona, os aspectos mais relevantes já foram discutidos anteriormente. Na síntese destes compostos híbridos derivados do ácido artesúnico é de salientar a existência de estereoquímica α em C10.
Aquando da formação do ácido artelínico com a presença do catalisador BF3.Et2O, formava-se o ião oxónio, que ao sofrer ataque do álcool do reagente ácido
4-hidroximetil-benzóico, originava o composto com uma conformação 10-β. Na síntese do ácido artesúnico, temos uma química diferente e esteroquímica diferente, com obtenção da conformação 10-α. A estereoquímica deste composto tem sido tema de vasta discussão. Antes de 2000, o Chemical Abstracts designava o artesunato como isómero 10-β, mas a partir deste ano foram atribuídas as estereoquímicas 10-β ou 10-α ou então como indefinida. Presentemente, sabe-se que a acilação da dihidroartemisinina com anidridos na presença de base, como a piridina, origina ésteres com uma estereoquímica 10-α. Mas qual a razão da formação de apenas o epímero α? A dihidroartemisinina existe como uma mistura 1:1 dos dois epímeros α e β, porém esta proporção pode ser alterada em função do solvente, onde em metanol e acetona a razão é de 2:1 (α/β) e em dimetilsufóxido de 3:1 (α/β). Verificou-se também que a adição de um equivalente de DMAP ou trietilamina causa uma alteração no equilíbrio de cerca de 1,5:1 a favor da estereoquímica α. Haynes et al efectuaram estudos computacionais adicionais e obtiveram as seguintes conclusões: a) a formação exclusiva do 10-α artesunato não pode ser atribuída a factores termodinâmicos, mas sim a fenómenos cinéticos; b) a presença da base não tem qualquer efeito na estereoquímica adoptada durante a acilação; c) são obtidos α-ésteres quando o grupo hidroxilo da dihidroartemisinina actua como nucleófilo e β-ésteres quando é activado por substituição; d) a formação de éteres catalisada por ácidos de Lewis origina maioritariamente o epímero β 237.
A atribuição da estereoquímica C10-α para os compostos sintetizados foi
verificada por ressonância magnética nuclear. Na Figura 2.15 pode-se ver parte do espectro de 1H-RMN do ácido artesúnico, referente ao sinal do protão H10, com um
desvio químico de 5,82 ppm e uma constante de acoplamento de 10,0 Hz com o protão H9, que corresponde a um arranjo trans-diaxial destes protões.
Figura 2.15 - Parte do espectro de 1H-RMN do ácido artesúnico, referente ao sinal de H10 e
respectiva constante de acoplamento (espectro efectuado em CDCl3).
Na Figura 2.16 é possível ver parte da estrutura do α-artesunato e β-artesunato e as relações trans-diaxiais e cis-equatorial-axial, entre H10 e H9, respectivamente. Este
raciocínio baseado na constante de acoplamento foi utilizado na atribuição da estereoquímica do ácido artelínico e dos demais compostos sintetizados, quando necessário. H10 H9 O O O CH3 O O O H9 O O O CH3 H10 O
α-ácido artesúnico β-ácido artesúnico
Figura 2.16 - Parte da estrutura do ácido artesúnico, onde se podem ver as interacções entre
H9 e H10: trans-diaxiais (α-ácido artesúnico) e cis-equatorial-axial (β-ácido artesúnico).
2.2.3 - Avaliação antimalárica in vitro
A actividade antimalárica destes dois híbridos C10-oxa derivados do ácido
artesúnico foi avaliada in vitro em várias estirpes de P. falciparum e foi também determinada a sua capacidade inibitória para a falcipaína-2. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 2.11.
C12-H
C10-H(β)
Tabela 2.11 - Actividade antimalárica em várias estirpes de P. falciparum e inibitória para
FP-2 dos híbridos C10-oxa derivados do ácido artesúnico.
Composto IC50± SD/ nM W2 FCR3 3D7 V1/S D6 FP-2 FP-3 2.19 3,97±0,2 1,40±0,3 2,50±0,60 1,30±0,10 4,30±0,10 1965± 895 ND 2.20 5,34±0,1 ND ND ND ND 898,0± 242 130±13 ART 10,6±0,9 5,40±0,5 9,70±4,2 4,20±0,50 14,5±1,2 -- -- DHART 1,90±0,1 0,800±0,0 2,10±0,30 0,800±0,10 2,10±0,10 -- -- ARTM 6,77±0,4 2,40±0,2 4,80±0,20 1,90±0,20 6,70±0,40 -- -- CQ 51,7±0,6 51,1±0,1 11,6±1,1 65,0±4,1 16,9±2,1 -- -- E64 -- -- -- -- -- 64,50±9,90 120
SD - Desvio Padrão; ND - Não Determinado; ART - artemisinina; DHART - dihidroartemisinina; ARTM - arteméter; CQ - cloroquina;
O híbrido 2.19 exibe melhor actividade antimalárica em várias estirpes de P. falciparum, relativamente aos fármacos utilizados em terapia, ou seja, a artemisinina, o arteméter e a cloroquina. Para o híbrido 2.20, o valor de IC50 apesar de ser
ligeiramente superior ao de 2.19, não é superior ao obtido para a artemisinina. A semelhança de IC50 destes dois híbridos parece indicar que a diferença estrutural de um
grupo CH2 entre eles, não representa uma diferença significativa na actividade
antimalárica destes híbridos.
Na inibição da falcipaína-2, estes híbridos apesar de conterem a sequência dipeptídica ideal, exibem valores de IC50 superiores ao do obtido para o inibidor E64.
No híbrido 2.12c (IC50 = 4,95 µM) que contém a mesma sequência dipeptídica e a
mesma fenilvinilsulfona, o valor de IC50 para a inibição da FP-2 é superior ao obtido
para os híbridos 2.19 (IC50 = 1,97 µM) e 2.20 (IC50 = 0,89 µM), o que pode indicar que
estes últimos derivados pelo facto de serem quimicamente mais instáveis, libertam mais facilmente a unidade dipeptidilvinilsulfona, de modo a esta poder actuar no local alvo.
2.2.4 - Avaliação da estabilidade
A estabilidade em plasma humano e em tampão fosfato a 37ºC foi estudada para estes dois híbridos e as constantes de velocidade e os tempos de semi-vida obtidos estão apresentados na Tabela 2.12.
Tabela 2.12 - Valores de kobs e t½ obtidos para os compostos em tampão fosfato isotónico pH 7,4 e plasma humano a 37ºC, e os respectivos valores de log P.
Híbrido kobs / h -1 t½ / h log Pa PBS Plasma Humano PBS Plasma Humano 2.19 6,7×10-4 1,8 > 1000 0,40 5,15 2.20 1,4×10-2 2,7×10-1 51 2,6 5,34
a - calculado através do programa ALOGPS 2.1 251
Existem apenas dois compostos estudados neste tipo de híbridos, razão pela qual não se efectuou qualquer correlação linear. Dos resultados obtidos pode-se afirmar que o composto menos lipofílico, 2.19, apresenta maior constante de velocidade e menor tempo de semi-vida em plasma humano, à semelhança do que acontecia nos híbridos C10-oxa derivados do ácido artelínico, apesar de não haver uma diferença significativa
no valor de log P comparativamente a 2.20. Comparando estes compostos com os híbridos C10-oxa anteriores, seria de esperar que fossem menos estáveis, o que se veio a
verificar de acordo com os valores de kobs obtidos. A razão reside no facto de estes
derivados do ácido artesúnico, conterem uma função éster, mais facilmente hidrolisável pelas esterases do plasma, comparativamente aos derivados do ácido artelínico, caracterizados pela ausência deste grupo funcional. O composto 2.19 apresenta um valor de kobs maior do que 2.20 em plasma, apesar de ambos conterem as mesmas
funções químicas, porém o composto 2.19 apresenta menos um grupo metilénico, o que parece indicar alguma selectividade das enzimas plasmáticas para a hidrólise.
Em relação aos valores obtidos em PBS, pode-se verificar que o derivado 2.20 é menos estável nestas condições do que 2.19, o que indica uma maior hidrólise química. O facto deste composto 2.20 apresentar maior constante de velocidade em PBS e menor constante de velocidade em plasma, parece indicar que existe uma diferença relativamente à hidrólise química e enzimática.
Para confirmar a facilidade de hidrólise destes híbridos, devido à presença do grupo éster, comparativamente aos híbridos derivados do ácido artelínico, os compostos