Em relação ao compartimento epitelial, quando pacientes fumantes de ambos os grupos foram comparados, a expressão em CB e CB+SB foram maiores no Grupo II (Figura 5, A. p<0,0001). Todos os pacientes do Grupo I que apresentaram a membrana basal descontínua tinham mais de 60 anos (Figura 5, B. p<0,0001). Outro dado significante foi a maior expressão de MMP-9 em fronts invasivos dos tabagistas quando comparado com a ausência de fronts invasivos em não fumantes (Figura 5, C. p=0,0225). Em relação a expressão de MMP-9 no estroma, pacientes do sexo masculino do Grupo II tiveram maior número de células com marcação citoplasmática do que pacientes do sexo masculino do Grupo I (Figura 5, D. p=0,0054). O mesmo foi observado quando apenas pacientes com mais de 60 anos foram analisados, o Grupo II obteve novamente maior número de células do estroma com expressão de MMP-9 (Figura 5, E. p=0,0101). Ademais, a análise de expressão de MMP-9 e γ2 no epitélio mostrou que no Grupo II as lesões com marcação de laminina-332 em CB+SB tinham maior expressão de MMP-9 (Figura 5, F. P=0,003).
Figura 4: Expressão de cadeia γ2 (A-E) e MMP-9 (F-H) em lesões orais. Controle negativo em CCE moderadamente diferenciado (A). O controle positivo de cadeia γ2 ao longo da interface epitelial-estromal em HFI, que mostra uma estrutura linear (seta, B). Lesão de alto risco com MB contínua (seta, C). CCE bem diferenciado com MB contínua (seta) e expressão da cadeia γ2 na camada SB (D). Front invasivo com coloração citoplasmática de cadeia γ2 em CCE moderadamente diferenciado (E). HFI com expressão de MMP-9 em células endoteliais (*, F). Lesão de alto risco com expressão MMP-9 em CB+SB (G). Expressão da enzima em células do estroma em torno de ninhos tumorais em CCE moderadamente diferenciado (*, H). Barra de escala=20 µm.
Figura 5: Gráficos de associação entre dados clínicos e perfil imuno-histoquímico. Pacientes fumantes do Grupo II com uma maior expressão de cadeia γ2 em CB e SB+CB do que os fumantes do grupo I (A, p<0,0001). Paciente do Grupo I com >60 anos tiveram MB com aspecto descontínuo (B, p<0,0001). Expressão MMP-9 em
fronts invasivos de fumantes foi maior do que em não fumantes (C, p=0,0225). Maior
expressão de MMP-9 em estroma de pacientes do sexo masculino pertencentes ao Grupo II (D, p=0,0054). O mesmo foi observado com os pacientes com mais de 60 anos (E, p=0,0101). O Grupo II com marcação da cadeia γ2 em CB+SB apresentaram maior número de células estromais com expressão de MMP-9 (F, p=0,003).
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6 DISCUSSÃO
Este estudo analisou o perfil molecular da cadeia γ2 da laminina-332 e da MMP-9 em lesões orais de alto risco de malignização e CCE invasivos. As características microscópicas foram avaliadas, e possíveis associações entre os fatores histológicos e clínicos da transformação maligna foram identificadas.
A maioria dos pacientes que participaram do estudo eram homens. Em relação à idade, no Grupo I foram mais prevalentes indivíduos acima de 60 anos e no Grupo II acima de 50 anos. Diferentes áreas da mucosa oral foram acometidas, mas o rebordo alveolar foi o sítio mais frequente. Pacientes fumantes foram maioria no Grupo II. Shenoi e colaboradores (2012), em estudo retrospectivo de 295 casos de CCE invasivos, mostraram que 81% dos pacientes eram homens, com 51-60 anos e o principal hábito que levou ao desenvolvimento do câncer foi o consumo de cigarros. O rebordo alveolar da mandíbula foi o sítio mais acometido. Dentro do contexto das lesões de alto risco, a leucoplasia geralmente ocorre em homens de meia idade (DOST et al. 2013) e a prevalência acentua-se consideravelmente em pacientes com mais de 70 anos. Mucosa bucal, gengiva e vermelhão do lábio caracterizam dois terços dos locais mais afetados (MORTAZANI et al, 2014; DOST et al, 2013). Nossos resultados estão em concordância com os trabalhos mencionados.
Mesmo com todo o desenvolvimento científico, o câncer permanece um desafio a ser superado. Vários estudos têm sido realizados com o intuito de propor novas terapias contra a progressão da doença, mas os vários tipos de câncer em diferentes tecidos e, os muitos mecanismos utilizados pelas células tumorais tornam difícil encontrar a chave que pode interromper o curso da doença. Porém, é consenso que quando interceptado em estágio inicial, a grande parte dos tumores tem prognóstico favorável. Um ponto relevante para melhorar o diagnóstico é o desenvolvimento de biomarcadores que permitam a detecção de alterações teciduais iniciais. As alterações na membrana basal representam passo importante na progressão do câncer (KULASEKARA et al, 2009). Já foi relatado que a carcinogênese depende de diferentes moléculas dessa estrutura, as quais são preferencialmente utilizadas como substratos para a invasão e proliferação tumoral (HIRASHIMA et al, 2013).
56 Assim, a análise da expressão da cadeia γ2 em tecidos de lesões de alto risco e CCE demonstrou que o Grupo I apresentava a maioria das lesões com membrana basal contínua, e nenhum caso com a membrana completamente ausente. Por outro lado, no Grupo II os casos tiveram membrana descontínua ou ausente. Esses achados estão em concordância com Imura e colaboradores (2012) que destacaram em seus achados em adenocarcinoma que a membrana basal permanecia contínua e linear enquanto a doença não alcançava estágios avançados. Assim, pode-se sugerir que o perfil de expressão da cadeia γ2 se modifica ao longo do processo de transformação e invasão tumoral.
No tecido conjuntivo, lesões do Grupo II mostraram expressão da cadeia γ2 na periferia de ilhas tumorais e alta concentração na interface tumor-estroma, especialmente em fronts invasivos. Preferencialmente, a expressão dessa cadeia em células de fronts invasivos foi associada à progressão do tumor e sugere que ela desempenha papel na aquisição de um perfil migratório, característica que é um requisito para a malignidade. Ainda, existe uma relação entre perda local da laminina na membrana basal e sua deposição no estroma, perto das células invasivas, onde o câncer tem um comportamento agressivo (BERNDT et al, 2001). Esse aspecto foi descrito em diferentes carcinomas epiteliais, como em esôfago, região colo-retal e pulmão (YAMAMOTO et al 2001; HLUBEK et al 2004; MOON et al. 2015).
Adicionalmente, laminina-332 estimula as células tumorais a formarem finas projeções na borda frontal do citoesqueleto, levando a um aumento da migração e invasão (FRANK; CARTER, 2004). A literatura vem associando proliferação, migração e invasão com a cadeia γ2 quando profundamente alterada, fato observado em recente estudo no qual houve redução nessas atividades em células silenciadas para expressão de LAMγ2 (GARG et al, 2014). Quando as associações foram analisadas, pode-se observar que a expressão da cadeia γ2 estava maior no epitélio do Grupo II em comparação ao Grupo I, em se tratando de pacientes fumantes. O tabaco é um fator de risco bem conhecido na carcinogênese, que facilita a aquisição de motilidade em células tumorais (GASPARONI et al, 2007). Motilidade esta que já foi relacionada com a presença da cadeia γ2 no citoplasma. Assim, podemos considerar que expressão da cadeia contribui para um fenótipo mais agressivo do tumor.
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Em relação à MMP-9, os resultados demonstraram diferenças entre os grupos e a marcação citoplasmática. Essa foi maior (mais do que 50% células/campo) em pacientes com CCE invasivos quando comparadas às lesões de alto risco. Tamamura e colaboradores (2013) encontraram em seus achados pouca ou nenhuma expressão de MMP-9 em displasias epiteliais orais (DEOs) e em CIS. Por outro lado, CCEs pobremente diferenciados tiveram elevada expressão da enzima. Jordan e colaboradores (2004) encontraram alta expressão de MMP-1 e -9 em DEOs e em CCEs invasivos, porém a expressão de MMP-9 mostrou-se presente em maior quantidade e em 100% dos carcinomas, sendo associada com a progressão tumoral. Achados semelhantes foram descritos por De Vicente e colaboradores (2005), que encontraram associação entre expressão de MMP-9 e o grau histológico das lesões. Em contrapartida, Kato e colaboradores (2005) mostraram que apesar da expressão de MMP-9 estar elevada em CCEs invasivos, sua atividade no tecido tumoral, analisada através de zimografia, era muito baixa impulsionando novos estudos nesse sentido.
A síntese de MMP-9 por células tumorais desempenha um papel importante na invasão do tecido subjacente, podendo representar a agressividade da doença (APARNA et al, 2015). A elevada expressão de MMP-9 foi detectada em fronts invasivos das amostras de fumantes. Esse achado corrobora com o fato de que MMPs têm a capacidade de modular invasão tumoral, sendo bem reconhecida sua expressão justamente nessas áreas de fronts tumorais (TAMAMURA et al., 2013).
Além do hábito de fumar, idade e sexo são aspectos clínicos importantes no desenvolvimento CCE invasivo. Quando pacientes com idade superior a 60 anos e do sexo masculino de ambos os grupos foram comparados, o Grupo II apresentou mais células com marcação citoplasmática de MMP-9 do que o Grupo I. O aumento dos grânulos de MMP-9 foi associado a um comportamento mais agressivo em pacientes do sexo masculino e idosos e, representou o aumento progressivo da síntese da enzima durante o processo de transformação maligna. A correlação positiva entre as duas moléculas (cadeia γ2 e MMP-9) foi demonstrada no epitélio do Grupo II. Casos com marcação de laminina em CB+SB tinham mais células estromais com expressão de MMP-9. Patel e colaboradores (2002) encontraram aproximadamente 90% das células epiteliais da camada basal marcadas para
58 cadeia γ2, diferentemente do observado no tecido normal, onde não existia essa expressão. Além disso, os autores encontraram MB descontínua em CCEs moderadamente diferenciados e indiferenciados.
A MB é a primeira barreira para migração de células neoplásicas, de maneira que sua perda pode ser associada ao processo de invasão e metástase. As MMPs estão envolvidas na clivagem da MB e remodelação da MEC (APARNA et al, 2015; FULLÁR et al, 2015). Além disso, o aumento de MMPs abre caminho para células que estão em transição epitélio-mesenquimal. Siegel e colaboradores (2011) relataram que 50% dos casos de CCE têm uma sobrevida de 5 anos e pior prognóstico quando comparado ao câncer de mama e/ou melanoma.
A análise da expressão da cadeia γ2 da laminina-332 e da MMP-9 em lesões de alto risco de malignizaçāo e em CCEs invasivos é fundamental para entender melhor as diferentes fases da carcinogênese. Ainda, buscar associações do perfil de expressão dessas moléculas com os dados clínicos permite compreender como fatores de risco interferem no microambiente tumoral. Expressão de laminina e MMPs pode representar uma ferramenta útil para predizer o comportamento da doença e se tornarem biomarcadores do processo invasivo durante o desenvolvimento do câncer de boca.
59
7 CONCLUSÃO
Os dados sugerem possíveis associações entre os aspectos clínicos e microscópicos. Pacientes fumantes com diagnóstico de CCE invasivo apresentaram expressão mais elevada da cadeia γ2 no compartimento epitelial, com membrana basal descontínua e alta expressão MMP-9 em fronts invasivos. Ainda, a expressão de MMP-9 no estroma foi prevalente em pacientes do sexo masculino e com mais de 60 anos também com diagnóstico de CCE invasivo. Embora ainda existam controvérsias na literatura, é possível observar que as proteínas estudadas apresentam mudanças no seu padrão na seqüência DEO-CIS-CCEs.
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