5. RESULTADOS
5.1 Associação entre resíduos de piretróides em mama e no tecido
A marcação das células de carcinoma de mama das cadelas deste
estudo pelo REα (Figura 1) e p63 (Figura 2) revelou o padrão habitual de
coloração nuclear, enquanto que a marcação pelo anticorpo HER-2 foi citoplasmática (Figura 3).
Figura 1. Imunoexpressão de receptor de estrógeno-α em carcinoma de mama de cadela. a) Ausência de marcação nas células neoplásicas (resultado negativo); b) Marcação nuclear nas células neoplásicas (imunorreatividade em mais de10% das células neoplásicas; reação positiva). (DAB, NovoLink, contracoloração com hematoxilina de Harris).
b bb
a aa
Figura 2. Imunoexpressão de p63 em carcinomas de mama de
cadelas. a) Ausência de marcação nas células neoplásicas (resultado negativo); b) Marcação nuclear positiva em mais de 50% das células neoplásicas (reação positiva). (DAB, NovoLink, contracoloração com hematoxilina de Harris).
a aa
b bb
Figura 3. Imunoexpressão de HER-2 em carcinomas mamários de
cadelas. a) ausência de marcação nas células neoplásicas (resultado negativo); b) marcação positiva 3+ (acentuadamente positiva; marcação completa de membrana; reação positiva). (DAB, NovoLink, contracoloração com hematoxilina de Harris).
Entre as amostras de mama das 50 cadelas avaliadas neste experimento, 44 não apresentaram resíduos de piretróides e seis (12%) apresentaram-se com resíduos de um ou mais piretróides (Tabela 3). Pelo
teste de χ² não houve associação entre a presença de piretróide em mama
com a ocorrência de carcinoma nos diferentes graus imunoistoquímicos de malignidade (p>0,05).
a aa
b bb
Tabela 3. Frequências de resíduos de piretróides na mama normal (Grupo Controle) e nos
carcinomas mamários (grupos Luminal A, Luminal B, Superexpressão de HER-2 e Basal) de cadelas.
Grupos Resíduos de piretróides n
Ausência Presença Controle 9 1 10 Luminal A 8 2 10 Luminal B 8 2 10 Superexpressão de HER-2 9 1 10 Basal 10 0 10 Total 44 6 50 p=0,6177 χ²calculado = 2,652
Em relação à presença de piretróides no tecido adiposo das 50 cadelas deste estudo, 40 não apresentaram resíduos de piretróides neste
tecido e 10 (20%) apresentaram (Tabela 4). Pelo teste de χ², não houve
associação entre a presença de piretróide no tecido adiposo com a ocorrência de carcinoma nos diferentes graus imunoistoquímicos de malignidade (p>0,05).
Tabela 4. Frequências de resíduos de piretróides no tecido adiposo adjacente a mama normal
(Grupo Controle) e aos carcinomas mamários (grupos Luminal A, Luminal B, Superexpressão de HER-2 e Basal) de cadelas.
Grupos Resíduos de piretróides n
Ausência Presença Controle 7 3 10 Luminal A 10 0 10 Luminal B 9 1 10 Superexpressão de HER-2 6 4 10 Basal 8 2 10 Total 40 10 50 p=0,1812 χ²calculado = 6,25
Ao associar as 100 amostras analisadas (50 de mama e 50 de tecido adiposo), embora a relação entre os níveis de cada um dos resíduos de piretróides investigados e o fenótipo imunoistoquímico dos carcinomas não
tenha sido significativa (p=0,3365), pelo teste de χ² (χ²calculado = 13,46),
observou-se que o resíduo mais frequente foi a deltametrina, a qual foi detectada em sete cadelas (uma do Grupo Controle e duas em cada um dos
grupos: Luminal A, Luminal B e Superexpressão de HER-2). O segundo piretróide mais encontrado foi a cipermetrina seguido da aletrina (Figura 4).
Figura 4. Identificação de cada piretróide investigado na mama e no tecido adiposo adjacente
à mama normal (Grupo Controle) e aos carcinomas mamários (grupos Luminal A, Luminal B, Superexpressão de HER-2 e Basal) de cadelas.
Quanto à quantificação dos piretróides, observou-se distribuição heterogênea na quantidade (em µg/g) de cada resíduo investigado entre os grupos avaliados e entre as amostras de mama e de tecido adiposo em um mesmo animal (Tabela 5).
Tabela 5. Quantificação (em µg/g) de cada piretróide investigado na mama e no tecido adiposo
adjacente à mama normal (Grupo Controle) e aos carcinomas mamários (grupos Luminal A, Luminal B, Super expressão de HER-2 e Basal) de 50 cadelas.
Controle Luminal A Luminal B Superexpressão
de HER-2 Basal Mama Tecido
Adiposo Mama Tecido Adiposo Mama Tecido Adiposo Mama Adiposo Tecido Mama Tecido Adiposo
nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0,02D nd nd nd nd nd nd 1,99C nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0,68C nd nd nd nd nd nd nd 0,20A nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 1,23A 0,12D 0,47A nd nd 0,17D 0,02D nd nd nd nd nd nd 0,09D nd nd nd nd 0,30C nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0,182,25DC nd nd nd 0,93A nd nd nd nd nd nd nd nd nd 0,15C nd nd 0,97D nd 0,30D 0,93T nd nd Limite de detecção = 0,001 µg/g nd = não detectado
A = Aletrina; C = Cipermetrina; D = Deltametrina; T = Tetrametrina 0 1 2 Aletrina Cipermetrina Deltametrina Tetrametrina N ú m er o d e in d iv íd u o s Grupos
5.2 Associação entre a intensidade de dano no DNA, resíduos de piretróides e agressividade dos carcinomas mamários de cadelas
Ao Ensaio Cometa, as células de mama neoplásicas e não neoplásicas citoaspiradas e tratadas com tripsina adquiriram o aspecto esperado de um cometa, com cabeça e cauda, cuja extensão variou com a intensidade de dano no DNA (Figura 5).
Figura 5. Fotomicrografias de células neoplásicas de mama de cadelas submetidas ao
Ensaio Cometa. Extensão da migração do DNA (cauda). a) Sem cauda, e com tamanhos diferentes de cauda (b, c, d). Syber Green, microscopia de fluorescência, 40x.
Não houve diferença estatística entre a intensidade de dano no DNA das células das mamas não neoplásicas e das células das mamas que apresentavam carcinoma (p>0,05) (Tabela 6). Ao comparar as diferenças na intensidade de dano entre os tipos imunoistoquímicos dos carcinomas avaliados, observou-se que a intensidade de dano no DNA foi discretamente
a b
maior nas células de carcinoma do tipo Luminal A em relação às células de carcinoma do tipo Luminal B e o dano nesta foi maior em relação as células do tipo Superexpressão de HER-2, as quais também apresentaram maior dano em relação ao tipo Basal, no entanto, as diferenças não foram significativas (p>0,05) (Tabela 6).
Tabela 6. Médias e respectivos desvios padrões (s) da intensidade de dano no
DNA em células de mama não neoplásicas (Grupo Controle) e células de mama que apresentavam carcinoma (grupos Luminal A, Luminal B, Superexpressão de HER-2 e Basal) de cadelas.
Grupos Intensidade de dano no DNA n
Média ± s Controle 5,95 ± 1,73 a 10 Luminal A 11,40 ± 7,55 a 10 Luminal B 10,70 ± 3,16 a 10 Superexpressão de HER-2 10,47 ± 4,81 a 10 Basal 10,13 ± 4,34 a 10 p=0,098
Médias seguidas de letras minúsculas iguais na mesma coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p>0,05).
Ao comparar à intensidade de dano no DNA das células de carcinoma de mama expostas e não expostas aos piretróides, a diferença não foi significativa (p>0,05) (Tabela 7).
Tabela 7. Médias e seus respectivos desvios padrões (s) da intensidade de dano
no DNA em células de carcinoma de mama de cadelas expostas e não expostas aos piretróides.
Piretróide Intensidade de dano no DNA n
Células não expostas 10,83 ± 5,17 a 30
Células expostas 10,21 ± 4,83 a 10
Médias seguidas de letras minúsculas iguais na mesma coluna não diferem estatisticamente entre si pelo Teste t de Student (p>0,05).