Atenuação de fluorescência: ambientes dos triptofanos

As alterações conformacionais da LAPr-Li foram monitoradas por atenuação de fluorescência utilizando atenuadores neutros e carregados. A atenuação da intensidade de fluorescência indica que os resíduos de Trp da molécula se encontram acessíveis ao atenuador. A figura 15 mostra que a acrilamida, um atenuador neutro, interage com a proteína e reduz a intensidade de fluorescência em aproximadamente 81%, com deslocamento dos espectros de 2 nm (332 nm para 330 nm), sugerindo um reposicionamento hipsocrômico dos Trp (para ambientes menos hidrofílicos).

Figura 15. Espectros de emissão de fluorescência da LAPr-Li em Tris-HCl 25 mM NaCl 200 mM pH 8,5 (A280nm <0.1) com adição de concentrações crescentes de acrilamida, a 25°C. Excitação em 295 nm.

(máx.: 332 nm). Em preto, o espectro da proteína na ausência do atenuador. O espectro verde é a

primeira titulação de acrilamida. Do espectro azul escuro em diante, são as demais titulações do atenuador de intensidade de fluorescência.

55 Os dados de atenuação da intensidade de fluorescência foram ajustados utilizando a equação clássica de Stern-Volmer (intensidade de fluorescência

versus concentração do atenuador), conforme observado na figura 16. A

curvatura está voltada para o eixo da ordenada, o que indica a ocorrência de dois tipos de atenuação: dinâmica (colisional) e estática (Laskowski, 2004). O ajuste dos dados, considerando o desvio padrão e 2 _{reduzidos, forneceu os}

valores das constantes de Stern-Volmer, que indicam o grau de exposição ou ambiente dos Trp (Figuras 17 e 18). O 2 reduzido foi adequado para todos os ajustes, e o desvio padrão e a distribuição residual apresentaram-se reduzidos para o ajuste de duas populações de Trp. Os valores de Ksv calculadas para os Trp enterrados e expostos foram de 5,4 M-1 _{e 13,2 M}-1_{, respectivamente. Para}

verificar se a acrilamida promove atenuação colisional e estática ao mesmo tempo, os dados de fluorescência foram ajustados também pela equação não linear, modificada de Stern-Volmer (Figura 16). A equação modificada de Stern- Volmer é indicada para determinar as constantes de atenuação estática e colisional para moléculas que apresentam muitos resíduos de Trp na estrutura (Ventura et al, 1976). Os valores das constantes, considerando os dois tipos de atenuação, foram: constante de atenuação estática (KS) para a população mais

enterrada foi de 0,17 M-1 e a constante dinâmica (KD) de 5,5 M-1. Para a segunda

população de Trp mais expostos, o valor de KS foi 0,01 M-1 e de KD foi 19,4 M-1.

Esses valores estão de acordo com aqueles encontrados pelo ajuste linear da curva (valores de Ksv), excetuando aquele encontrado para a população de Trp mais expostos (KD = 19,4 M-1 e Ksv = 13,2 M-1). Esses dados confirmam que o

efeito da acrilamida é preferencialmente a atenuação dinâmica ou colisional, dado os baixos valores encontrados para a constante Ks.

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Figura 16. Gráfico de Stern-Volmer para a atenuação de fluorescência da LAPr-Li por acrilamida, em tampão Tris-HCl 25 mM NaCl 200 mM pH 8,5. F0 é a intensidade de fluorescência na ausência e F na presença de acrilamida. A linha sólida representa a curva ajustada (método de Lenvenberg- Marguardt). As constantes estática KS e dinâmica KD foram calculadas com os valores de 0,17 M-1 e

5,5 M-1_{, respectivamente, para a população mais enterrada e 0,01 M}-1 _{e 19,4 M}-1_{, respectivamente,}

para a mais exposta de Trp.

Figura 17.Gráfico de Stern-Volmer para atenuação de fluorescência por acrilamida para a população menos exposta de Trp de LAPr-Li em Tris-HCl 25 mM NaCl 200 mM pH 8,5. A linha sólida representa a curva ajustada por método linear. O valor de KSV para essa população foi de 5,4 M-1.

57 A adição de iodeto, atenuador de carga negativa, à solução de LAPr-Li com variação da força iônica, promoveu redução mínima da intensidade de fluorescência indicando baixo ou nenhum acesso aos microambientes dos Trp (Figura 19). Apesar de baixo efeito na atenuação, foi observada uma maior atenuação da intensidade de fluorescência por iodeto quando a força iônica foi de 1,0 (Figura 19), apresentando maior valor de KSV (Figura 20) e tabela IV. O

aumento da força iônica ocasionou mudanças no padrão das interações não covalentes da proteína e favoreceu a atração eletrostática entre o atenuador e o fluoróforo (Ventura et al, 1976). No entanto, os valores dessas constantes indicam o baixo acesso do atenuador aos fluoróforos que aqui foram caracterizados como Trp enterrados.

Figura 18. Gráfico de Stern-Volmer para atenuação de fluorescência por acrilamida para a população mais exposta de Trp de LAPr-Li em Tris-HCl 25 mM NaCl 200 mM pH 8,5. A linha sólida representa a curva ajustada por método linear. O valor de KSV para essa população foi de 13,2 M-1.

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Figura 19. Espectros de emissão fluorescente da LAPr-Li em tampão Tris-HCl 20 mM NaCl 200 mM pH 8,5 com adição de concentrações crescentes de iodeto de potássio submetidas a diferentes forças iônicas, a 25°C. Excitação em 295 nm.

Figura 20. Gráfico de Stern-Volmer para a atenuação de fluorescência da LAPr-Li por I- _{em diferentes}

força iônica, em tampão Tris-HCl 25 mM, NaCl 200 mM pH 8,5. KSV representa a inclinação da reta, F0 a

intensidade de fluorescência na ausência e F na presença do atenuador, respectivamente. A linha sólida representa a curva ajustada pela equação clássica de Ster-Volmer.

59 A adição de cloreto de césio, atenuador de carga positiva, reduziu significantemente a intensidade de fluorescência, mostrando que o microambiente em que os resíduos de triptofanos da LAPr-Li se encontram é carregado negativamente (Figura 21). Nesse caso, os trp podem estar envolvidos com interações não-covalentes com resíduos de aminoácidos de carga negativa. Os espectros apresentam duas bandas de emissão, centradas em 332 nm e 342 nm, o que indica a presença de outra forma estrutural da LAPr- Li, além do hexâmero. O ajuste do gráfico de Stern-Volmer para o Cs+ foi feito para duas populações de Trp (Figura 22), sendo ambas as populações de ambientes de caráter negativo.

Tabela IV. Constantes de Stern-Volmer para iodeto de potássio com variação da força iônica, em pH 8,5. KSV1 representa a população mais exposta de Trp e a KSV2, a menos

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Figura 21. Espectros de emissão fluorescente da LAPr-Li em tampão Tris-HCl 20 mM NaCl 200 mM pH 8,5 com adição de concentrações crescentes de cloreto de césio, a 25°C. Excitação em 295 nm.

Figura 22. Gráfico de Stern-Volmer para a atenuação de fluorescência por CS+ da LAPr-Li em tampão Tris-HCl 25 mM, NaCl 200 mM pH 8,5. F0, fluorescência na ausência e F na presença do atenuador, respectivamente. As curvas ajustadas por método linear, considerando duas populações de Trp resultaram nos valores de KSV representadas na tabela V abaixo.

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Figura 23. Gráfico de Stern-Volmer para atenuação de fluorescência por CS+ para a população mais exposta de Trp de LAPr-Li em Tris-HCl 25 mM NaCl 200 mM pH 8,5. A linha sólida representa a curva ajustada por método linear. O valor de KSV para essa população foi de 38,6 M-1.

Figura 24. Gráfico de Stern-Volmer para atenuação de fluorescência por Cs+ para a população menos exposta de trp de LAPr-Li em Tris-HCl 25 mM NaCl 200 mM pH 8,5. A linha sólida representa a curva ajustada por método linear. O valor de KSV para essa população foi igual a 6,2 M-1.

62 Os valores das constantes de Stern-Volmer para cada atenuador utilizado no estudo estrutural de LAPr-Li nativa estão representados na tabela VI. Todos os atenuadores indicaram duas populações de resíduos de triptofanos uma exposta e outra enterrada. No entanto, para a acrilamida (raio de 1,7 Å) esse efeito foi mais evidente em virtude do poder de penetração desse atenuador na matriz protéica O acesso dos atenuadores carregados aos resíduos de triptofanos variou principalmente pela diferença de cargas e não pelo tamanho, uma vez que os três atenuadores apresentam raios similares (I- _{2.,16 Å, Cs}+ _1,69

Å) (Ventura et al, 1976). A interação entre o fluoróforo e o atenuador depende da posição em que os triptofanos se encontram e da carga dos aminoácidos de seu microambiente.