Cette méthode offre l'avantage de travailler sur des cellules entières, de conserver une
intégrité, une architecture et une communication entre cellules adjacentes. L'hétérogénéité et les capacités biochimiques de l'organe entier sont conservées. Il existe des différences
qualitatives et quantitatives entre les différentes sources et au sein de chaque espèce. De façon générale, l'expression du cytochrome P450 est généralement perdue durant les cultures de cellules dérivées de tissu humain et ce phénomène se manifeste ici de feçon
importante. Leur activité métabolique est souvent plus restreinte que lors d'utilisation d'autres modèles in vitro et le temps d'utilisation est limité à quelques heures (jusqu'à 4 heures), une diminution importante de l'activité du CYP étant enregistrée pour des temps prolongés [Ekins, 2000 ] [Guengerich, 1996 ] [Olinga, 1998 ] [VandenBranden, 1998 ].
La standardisation des méthodes de prélèvement, connaissance du donneur (passé clinique et médicamenteux...), de coupes, l'utilisation et le développement de méthodes de
1.6.2.2. Hépatocytes
Les suspensions ou les cultures à court terme d'hépatocytes isolés sont utiles pour étudier les effets immédiats comme la biotransformation des médicaments, la cytotoxicité, les études génétiques....Les hépatocytes en suspension ou en culture en couche unique se différencient très rapidement et ne peuvent survivre que pendant 4 à 5 heures, après quoi elles auront perdu toute fonction spécifique liée au foie. Les hépatocytes en culture primaire peuvent survivre pendant 2 à 4 jours.
Les modèles reposant sur les cultures d'hépatocytes à plus long terme (une à deux semaines! sont utiles pour déceler et expliquer des effets prolongés tels que l'induction, la toxicité chronique et les interactions médicamenteuses. Pour les cultures à plus long terme, im ensemble de facteurs se sont révélés importants pour reproduire l'environnement in vivo des cellules hépatiques (c'est-à-dire les interactions cellulaires): les contacts matriciels
extracellulaires, la présence de certains composés solubles et de cocultures. De nombreuses études ont déjà été menées avec pour but de prolonger la vie des hépatocytes, aucun système de culture idéal n'a été proposé. Il convient cependant de signaler que les cultures
d'hépatocytes (rat ou humain) en gel de collagène parviennent à conserver leur capacité de métabolisation environ deux semaines [Davila, 1998 ] [Arterbum, 1995 ].
Les méthodes préconisées pour l'augmentation des capacités métaboliques des hépatocytes passent par le développement de méthodes de cryoconservation performantes. En effet, les hépatocytes sont le plus souvent disponibles en quantité importante (en une fois, lors d'un prélèvement d'organe) et nécessitent un stockage jusqu'au moment de leur utilisation. Il feut remarquer que la spécificité enzymatique n'est pas garantie (plusieurs isoformes présents) et il existe des différences quantitative et qualitative selon les prélèvements (donneurs: états pathologiques éventuels, prise de médicaments, âge, phénotype...). Il faut cependant remarquer que l'utilisation de cellules de foie humain (notamment
d'hépatocytes) revêt une importance particulière étant donné que l'on évite l'extrapolation de l'animal à l'homme [Madan, 1999 ] [Ekins, 2000 ] [Guengerich, 1996 ] [Olinga, 1998 ]..
1.6.2.3. Fractions subcellulaires
Les fractions subcellulaires incluant les microsomes sont parmi les modèles in vitro les plus utilisés dans les études de métabolisation. Le développement des méthodes de centrifugation a permis la localisation de différents enzymes dans des fractions subcellulaires particulières. Ces méthodes présentent différents avantages: leur facilité de préparation, leur capacité de stockage à long terme (si cryoconservés) et leurs conditions d'incubation facilement contrôlables [Ekins, 2000 ] [Guengerich, 1996 ].
Le désavantage primordial réside dans le fait que certains des enzymes sont relativement labiles et l'utilisation de ces méthodes requiert l'addition de cofacteurs pour ime activité optimale afin de remplacer la perte due à l'absence d'intégrité cellulaire. De plus, il est nécessaire de retourner à l'organe de départ étant donné l'impossibilité de division. Les différents lots de microsomes préparés proviennent de sources différentes ayant chacune leur capacité enzymatique propre (qualitative et quantitative). De plus, plusieurs isoformes sont parfois présents et le coût d'études de métabolisation in vitro utilisant les microsomes est largement supérieur à celui d'études sur systèmes recombinants.
11 existe actuellement, des microsomes commercialement disponibles exprimant un seul type
d'isoforme: il s'agit de fractions microsomiales obtenues à partir de systèmes hétérologues utilisant les systèmes recombinants ou à partir de cellules d'une lignée cellulaire exprimant vm seul isoforme. La connaissance précise de la voie métabolique est alors possible et la
détermination des isoformes impliqués dans la métabolisation peut être envisagée selon les
méthodes décrites au point 1.5. .
1.6.2.4. Systèmes recombinants
Un moyen pour comprendre un système complexe est de se placer du point de vue le plus réductionniste et isoler l'unité la plus petite possible. Dans le cas de la métabolisation, il s'agit de l'enzyme responsable pour une réaction définie. Il existe actuellement des systèmes
recombinants exprimant une enzyme définie. Depuis le début des années 1990, plus de 100 gènes du CYP ont été séquencés et clonés incluant les principaux isoformes impliqués dans la métabolisation chez l'homme. Il existe différents systèmes d'expression stable d'isoformes différents du système du cytochrome P450 comprenant des bactéries, levures et cellules de mammifères. L'utilisation d'ADNc exprimant im isoforme spécifique et son cofacteur
enzymatique (cytochrome P450 réductase) [Townsend, 1999 ] a permis de grand progrès dans la compréhension de la spécificité concernant le substrat ou l'inhibiteur par exemple.
Ces lignées cellulaires continues présentent une capacité de division infinie dans le temps (génération spontanée) et une expression stable de l'activité enzymatique, généralement pour un isoforme bien défini.
Outre les systèmes recombinants, il existe d'autres lignées cellulaires continues ayant la capacité de se diviser et conservant l'équipement enzymatique des cellules de départ: HEPG2, CACO 2 (qui possèdent, en plus de leur équipement enzymatique, un système de transport transmembranaire de type P-gP utilisé dans les études d'absorption) [Schmiedlin, 1997 ] [Hu, 1999 ] [Ekins, 2000 ] [Guengerich, 1996 ] [Guengerich, 1997, a ] [Raeissi, 1997 ] [Crespi, 1996 ] [Crespi, 1997 ]...
Leur utilisation est importante dans les méthodes de screening et d'études de biodisponibilité concernant de nouvelles substances, d'étude d'un mécanisme impliquant un isoforme
particulier, de formation de métabolites particuliers....
Le niveau d'organisation ainsi que la viabilité relative rencontrées dans les différentes méthodes in vitro utilisées couramment lors des études de métabolisation sont repris dans le
tableau 1.7. .
Tableau 1.7.
Alternatives biologiques (mammifères) dans la recherche pharmaco-toxicologique.
Viabilité courte Viabilité prolongée Niveau d'organisation
organes isolés et perfusés ++++
coupes d'organes +++
cellules isolées cultures de cellules primaires +
lignées de cellules continues +
fractions subcellulaires 0/ +
enzymes purifiés 0
1.6.3. APPLICATIONS DES MODELES IN VITRO
Ces différents modèles offrent de grandes possibilités pour les études de métabolisme. Ces modèles sont de plus en plus facilement accessibles, néanmoins, ils nécessitent des
Différentes recommandations concernant les aspects pratiques et logistiques pour la validation de méthodes alternatives ont été proposées [Bail, 1995 ] [Sauer, 2000 ].
Cinq étapes semblent importantes: mise au point du test dans le laboratoire d'origine, la prévalidation fondée sur une étude informelle entre laboratoires, la validation par une étude formelle interlaboratoire (incluant ime expérience en aveugle), l'appréciation objective de l'étude et des propositions et la poursuite d'essais jusqu'au moment de l'agréation légale. L'application réussie de méthodes in vitro pourrait hâter le moment où ü est décidé qu'une molécule mérite une recherche plus poussée. Autrement dit, dans la courbe d'échecs du
développement d'une NCE {figure 1.15.), le délai de décision lors de la phase préclinique est
décalé vers la gauche, ce qui entraîne une réduction des frais.
Figure 1.15.
Causes d'échecs du développement d'une NCE.
Les méthodes in vitro dans le domaine préclinique peuvent doimer un certain nombre de renseignements pour chaque NCE (X) ;
- Quels sont les systèmes enzymatiques impliqués?
- Est-ce que X est métabolisé par l'intermédiaire de métabolites cytotoxiques? - Existe-t-il un polymorphisme génétique?
- Est-ce que X est un inducteur ou un inhibiteur enzymatique? - Y-a-t-il un risque d'interactions médicamenteuses?
Tous ces points peuvent aussi être abordés par la recherche in vivo sachant que quelques
avantages peuvent être obtenus lors de l'utilisation de techniques in vitro: - de plus petites quantités de molécules parentes ou de métabolites suffisent
- le contrôle externe de méthodes in vitro est souvent meilleur permettant de détecter plus facilement des mécanismes d'action et de toxicité permettant d'orienter de façon plus adéquate la recherche préclinique (suppression de tests inutiles)
- constitue souvent un moyen particulièrement adéquat pour comprendre un problème déterminé
- possibilité d'utiliser très tôt des tissus ou cellules humaines alors que l'utilisation chez l'homme est toujours hasardeuse et inacceptable d'un point de vue éthique
- diminution importante des tests réalisés sur animaux (avantages éthiques et au point de vue du coût)
- rapidité et coûts globaux moins importants (études arrêtées plus tôt, moins d'animaux....). Il faut remarquer que l'extrapolation de l'animal à l'homme reste toujours hasardeuse (différence d'absorption, métabolisation, divergences lors de mécanismes d'induction, d'inhibition ou d'interactions...) et peut mener à des conclusions erronées. L'utilisation de méthodes alternatives permet parfois de limiter les erreurs bien qu'il existe également des difficultés d'interprétation notamment pour les dérivés présentant diverses voies de métabolisation
Bien que l'utilisation de modèles animaux ne puisse être supprimé, les méthodes alternatives permettent de diminuer leur nombre et de prévoir certains résultats à un stade précoce.
CHAPITRE 2 :
METHODES GENERALES UTILISEES DANS LE TRAVAIL Y COMPRIS CERTAINS ASPECTS LIES A LA CARACTERISATION DU MODELE CELLULAIRE