Atividade antifúngica

4.5.1. Preparo das amostras para ensaios com linhagens de fungos filamentosos

Os óleos essenciais foram diluídos em meio RPMI 1640 com o auxílio de uma solução de 0,5% de Tween 20 e DMSO, este último até uma concentração máxima de 10%. O biossurfactante semipurificado foi diluído diretamente no meio de cultura. Nas misturas de óleos essenciais com 0,1 mg.mL-1 de surfactina, foi adicionada a solução de 0,5% de Tween 20 até a completa dispersão do óleo. Já para as misturas com 1,0, 5,0 e 10,0 mg.mL-1, os óleos essenciais foram diluídos somente com o biossurfactante.

A Tabela 3 apresenta as concentrações iniciais de óleo essencial, surfactina e do antifúngico padrão Cercobin® nas amostras testadas para os experimentos de CIM com linhagens de fungos filamentosos e a Tabela 4 apresenta a concentração de óleos essenciais e surfactina nos meios de cultura utilizados para a cinética de crescimento fúngico.

Tabela 3: Concentração inicial (mg.mL-1) de óleo essencial, surfactina e Cercobin® nas

amostras utilizadas para a determinação de CIM para diferentes linhagens de fungos filamentosos.

Amostra _essencial Óleo Surfactina _Cercobin®

Óleo essencial 2,0 - - Surfactina 0,1 2,0 0,1 - Surfactina 1,0 2,0 1,0 - Surfactina 5,0 2,0 5,0 - Surfactina 10,0 2,0 10,0 - Surfactina - 10,0 - Cercobin® - - 0,005

Tabela 4: Concentração (µg.mL-1) de óleo essencial e surfactina nos meios de cultura utilizadas para a cinética de crescimento de diferentes linhagens de fungos filamentosos.

Ensaio Amostra _essencial Óleo Surfactina

B. cinerea e V. pirina* Óleo essencial 20 -

B. cinerea e V. pirina* Surfactina 1 µg.mL-1 _{20 1}

B. cinerea e V. pirina* Surfactina 25 µg.mL-1 _{20 25}

B. cinerea e V. pirina Surfactina 1 µg.mL-1 _{- 1}

B. cinerea e V. pirina Surfactina 25 µg.mL-1 - 25

Demais fungos Óleo essencial 100 - Demais fungos Surfactina 5 µg.mL-1 100 5 Demais fungos Surfactina 125 µg.mL-1 100 125 Demais fungos Surfactina 5 µg.mL-1 _{- 5}

Demais fungos Surfactina 125 µg.mL-1 _{- 125}

* A concentração do óleo essencial de L. sidoides para os experimentos com V. pirina foi de 100 µg.mL-1_.

4.5.2. Linhagens de fungos filamentosos utilizadas

Foram utilizadas as linhagens dos fungos filamentosos fitopatógenos:

Alternaria alternata CCT 1250, Alternaria solani CCT 2673, Mucor hiemalis CBMAI

0547, Venturia pirina CCT 3166, Colletotrichum gloeosporioides CBMAI 0864,

Aspergillus flavus NRRL 3251 e Botrytis cinerea CCT 1252.

Os meios de cultura para repique e cinética de crescimento foram MEA para A. alternata, A. solani e M. hiemalis, CYA para A. flavus, Ágar Extrato de Aveia para B. cinerea e PDA (Marca DIFCO) para C. gloeosporioides e V. pirina.

O meio MEA foi preparado com 0,5% de peptona, 2,0% de extrato de malte e 1,5% de ágar em água destilada.

A composição do meio CYA utilizado foi: 20% sacarose, 0,1% K2HPO4,

0,7% extrato de levedura, 1,5% ágar, 0,1% (v:v) solução metálica (ZnSO4·7H2O

0,1 g e CuSO4·5H2O 0,05 g em 100 mL de água destilada) e 1% (v:v) solução

Czapek (NaNO3 30 g, KCl 5 g; MgSO4·7H2O 5 g e FeSO4·7H2O 0,1 g em 100 mL

de água destilada).

O meio ágar extrato de aveia foi obtido fervendo-se 30 g de aveia em flocos em um litro de água destilada por duas horas, depois o extrato foi filtrado, teve o seu o volume completado novamente para um litro e acrescentou-se 1,5% de ágar (SERRA, 2005).

4.5.3. Preparo do Inóculo

Os fungos filamentosos foram repicados em meios de cultura contendo ágar descritos a seguir e incubados em temperatura ambiente até o desenvolvimento de esporos. Para o preparo do inóculo, foi realizada a suspensão de esporos utilizando-se uma solução de 0,5% de Tween 20 estéril e padronização por diluição em solução salina 0,85% para uma absorbância na faixa de 0,08 a 0,10 a 530 nm. No caso do fungo V. pirina, foi feita a contagem de esporos em câmara de Neubauer. A suspensão de esporos padronizada foi então diluída até 105 UCF.mL-1 em meio RPMI para os ensaios de concentração inibitória mínima e em solução salina 0,85% para os ensaios de cinética de crescimento (CSLI, 2002 a).

4.5.4. Determinação da atividade antifúngica pelo método da microdiluição O método utilizado para avaliação de atividade antifúngica foi o de concentração inibitória mínima por microdiluição em caldo (CSLI, 2002 a). Para tanto, foram adicionados em todos os poços 0,1 mL de RPMI 1640 e em seguida foi feita a diluição seriada de 0,1 mL das amostras (Tabela 3). Foi adicionado aos poços 0,1 mL de inóculo padronizado, conforme descrito no item 4.5.3, resultando em uma concentração final de 5 x 104 _UFC.mL-1_{. As placas foram incubadas a}

temperatura ambiente por 5 dias para leitura dos resultados. A concentração inibitória mínima foi a mínima concentração em que não foi visualizada a turvação do meio de cultura.

Os testes foram desenvolvidos simultaneamente para o controle negativo (somente meio de cultura), controle positivo (meio de cultura + micro-organismo) e controle de esterilidade (meio de cultura + amostra).

Foram realizadas duas repetições dos ensaios com amostras em duplicata.

4.5.5. Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)

Para a determinação da CFM, foram retirados 5 µL de cada poço em que não foi visualizado crescimento fúngico na CIM e inoculados em ágar específico para cada fungo. Após incubação por 5 dias à temperatura ambiente, foi

considerada a CFM a mínima concentração em que não houve crescimento fúngico em ágar.

A fim de se determinar a natureza do efeito antifúngico, foi calculada a razão entre CFM e CIM. Quando esta foi maior do que 2, a ação foi considerada fungistática, caso contrário, o modo de ação foi considerado fungicida (HAFIDH et

al., 2011).

4.5.6. Determinação da cinética de crescimento

Os óleos essenciais que apresentaram melhores resultados para a CIM quando usados em conjunto com a surfactina, foram selecionados para o desenvolvimento de uma cinética de crescimento, cujo objetivo foi determinar a velocidade de crescimento radial dos fungos variando-se a concentração de surfactina adicionada à uma concentração sub-CIM de óleo essencial.

Para tanto, as amostras diluídas foram adicionadas nas concentrações mostradas na Tabela 4 ao ágar liquefeito específico para cada fungo (item 4.5.2) e 6 mL destes meios de cultura foram imediatamente adicionados a placas de petri estéreis descartáveis 49x13 mm. Após solidificação do meio, foi retirado um círculo de ágar do centro da placa, formando um poço de 1 mm de diâmetro.

Foram adicionados aos poços 4 µL de inóculo. As placas foram incubadas em temperatura ambiente e foram realizadas medições periódicas do raio de crescimento. A velocidade de crescimento foi calculada através da razão entre o raio formado e tempo (REESLEV; KJØLLER, 1995).

Os experimentos para determinação da cinética de crescimento foram realizados com amostras em triplicata.