2. Revisão da Literatura
3.4. Conclusão
4.3.8. Atividade antimicrobiana
O EPL apresentou atividade antimicrobiana contra as quatro bactérias testadas (Tabela 2), as quais foram escolhidas por sua presença ser muito relatada em alimentos. Os melhores resultados obtidos foram contra S. aureus e L. monocytogenes, com CIM de 0,62 mg mL-1 e CBM de 1,25 mg mL-1, para ambas bactérias. Observou-se que as bactérias Gram-positivas foram mais suscetíveis ao EPL do que as Gram-negativas, o que já foi relatado em outros estudos (MASCHERONI et al., 2014; das NEVES et al. 2016; ALMEIDA et al., 2017).
Tabela 2. Atividade antimicrobiana, concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) de extrato de própolisa contra diferentes bactérias
Bactérias CIM (mg mL-1) CBM (mg mL-1) Staphylococcus aureus 0,62 1,25 Listeria monocytogenes 0,62 1,25 Salmonella Typhimurium 2,5 20 Escherichia coli 1,25 10 a
O extrato etanólico de própolis foi rotaevaporado e liofilizado e o pó foi ressuspendido em dimetilsulfóxido (DMSO).
Isso pode ser explicado pelas diferenças na estrutura celular das bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. A parede celular das bactérias Gram-positivas,
constituída de aproximadamente 90%-95% de peptidoglicano, permite que as moléculas penetrem mais facilmente nas células microbianas. Já as bactérias Gram- negativas, possuem uma membrana externa composta de uma camada dupla de fosfolipídeos que está ligada à membrana interna por lipopolissacarídeos (LPS). Os lipopolissacarídeos promovem uma barreira à permeabilidade, e são os responsáveis pela antigenicidade, toxicidade e virulência das bactérias Gram- negativas, o que propicia maior resistência aos extratos naturais com atividade antimicrobiana (NIKAIDO, 1994). Dentre as bactérias Gram-negativas testadas, E. coli foi a mais suscetível ao EPL, com CIM de 1,25 mg mL-1 e CBM de 10 mg mL-1.
A atividade antimicrobiana da própolis tem sido atribuída, tanto aos compostos fenólicos de caráter hidrofílico quanto hidrofóbico, como os flavonoides e os ácidos e ésteres aromáticos, os quais possivelmente atuem na parede celular destas bactérias (PATEL et al., 2015),
Das Neves et al. (2016) encontraram resultados inferiores de CIM (0,26 mg mL-1
)
para extrato etanólico de própolis vermelha contra S. aureus. Almeida et al. (2017), utilizando extrato de clorofórmio da própolis vermelha, também encontraram atividade antibacteriana na faixa de concentração de 0,1-2 mg mL-1 para S. aureus.As diferenças encontradas nas CIM de EPL nos diferentes estudos pode ser explicada devido aos distintos processos de extração utilizados para a obtenção dos extratos. Dependendo do processo, muitas vezes se obtém uma pequena quantidade de compostos bioativos com ação antimicrobiana e grande quantidade de substâncias que são extraídas sem atividade antimicrobiana, como as resinas e ceras presente na própolis bruta (ALMEIDA et al., 2017). O efeito antimicrobiano de extrato de própolis foi correlacionado com sua composição complexa, principalmente pela presença dos flavonoides (PATEL et al., 2015), o que está de acordo com o alto teor de flavonoides encontrado neste estudo (dados não demonstrados).
Todas as MP apresentaram atividade antimicrobiana contra as bactérias Gram-positivas S. aureus e L. monocytogenes (Tabela 3), porém, não apresentaram ação contra as bactérias Gram-negativas S. Typhimurium e E. coli, nas concentrações avaliadas.
Tabela 3. Atividade antimicrobiana, concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) das micropartículas de extrato de própolis contra Staphylococcus aureus e Listeria
monocytogenes
Micropartículas
Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes
CIM (mg mL-1) CBM (mg mL-1) CIM (mg mL-1) CBM (mg mL-1) 1 >80 >80 >80 >80 2 20 30 20 30 3 5 30 10 10 4 >80 >80 >80 >80 5 >80 >80 >80 >80 6 >80 >80 >80 >80
Micropartículas: 1) 1% de extrato de própolis (EP) e 2% de proteína concentrada de ervilha (PCE); 2) 2,5% de EP e 2% de PCE; 3) 5% de EP e 2% de PCE; 4) 1% de EP e 4% de PCE; 5) 2,5% de EP e 4% de PCE; 6) 5% de EP e 4% de PCE.
O incremento da concentração de EP nas micropartículas nos tratamentos com 2% de PCE (tratamentos 1, 2 e 3), aumentou a capacidade de inibição das bactérias Gram-positivas avaliadas. Porém, nos tratamentos 4, 5 e 6, onde foi utilizada maior concentração de material de parede (4%), não foi observada atividade antimicrobiana na concentração máxima testada (>80 mg mL-1). Possivelmente, a maior concentração da proteína tenha impedido a ação do EP por dificultar a permeação do extrato para o interior da célula microbiana, ou por ter ocasionado maior barreira física à sua liberação. Resultado semelhante foi obtido por Almeida et al. (2017), os quais demonstraram que o aumento na concentração do material de parede (>20% para pectina, >30% para goma guar) reduziu a atividade antimicrobiana das microcápsulas de EP, em função de uma possível quelação insolúvel do material de parede com os flavonoides do EP. Segundo aqueles autores, essa quelação teria ocasionado o atraso na liberação dos flavonoides.
Comparando-se a atividade antimicrobiana do EPL (Tabela 2) com a do MP, através da CIM e da CBM (Tabela 3), pode-se observar que o EPL apresentou atividade antimicrobiana superior a das MP, devido a menor concentração do EP nas micropartículas em relação ao extrato puro. O mesmo comportamento foi observado por Nori et al. (2011), Mascheroni et al. (2014) e Almeida et al. (2017), quando compararam a atividade antimicrobiana de EP e de microcápsulas produzidas com diferentes materiais de parede. Os autores atribuem esses resultados ao tipo e a concentração do material de parede utilizado, além da
diferença de concentração dos compostos do EP dentro das micropartículas secas e o teor presente nas amostras de EP bruto.
A liberação dos compostos encapsulados nos tratamentos em que foram utilizados 2,5% de EP e 2% de PCE, bem como onde utilizou-se 5% de EP e 2% de PCE, apresentaram efeito bacteriostático, e mesmo bactericida, contra S. aureus e L. monocytogenes.
4.4. Conclusão
A microencapsulação, utilizando proteína de ervilha como material de parede, proporciona a proteção do extrato de própolis. As micropartículas contendo 2% de proteína de ervilha e 5% de extrato de própolis apresentam a melhor eficiência de encapsulação, bem como melhor rendimento e maior atividade antioxidante. O extrato de própolis demonstrou atividade antimicrobiana contra bactérias Gram- positivas (L. monocytogenes e S. aureus) e Gram-negativas (S. Typhimurium e E. coli O157:H7). As micropartículas elaboradas com 2% de proteína de ervilha e com 2,5 e 5% de extrato de própolis apresentaram atividade antimicrobiana contra L. monocytogenes e S. aureus.
As micropartículas produzidas com proteína de ervilha como material de parede e extrato de própolis como componente bioativo, apresentam potencial para serem utilizadas como ingrediente em alimentos. Estudos futuros são necessários para investigar as propriedades de liberação das micropartículas e a sua estabilidade durante o armazenamento.
Agradecimentos
A CAPES e a FAPERGS pelo apoio financeiro, ao CEME-SUL (FURG) pela realização das análises de MEV e difração de Raios-X e ao Centro de Desenvolvimento e Controle de Biomateriais (CDC-Bio/UFPel) pela análise de viscosidade.
Referências:
ALMEIDA, E. T. DA CRUZ; SILVA, M. C. D. DA; OLIVEIRA, R. K.; ARRUDA, R. E. DOS S.; VIEIRA, D. A.. SILVA, V. DA C.; ESCODRO, P. B.; BASÍLIO-JÚNIORA, I.
D.; NASCIMENTO, T. G. do. Chemical and microbiological characterization of tinctures and microcapsules loaded with Brazilian red propolis extract. Journal of
Pharmaceutical Analysis, v. 7(5), p. 280-287, 2017.
ANDRADE, J. K. S.; DENADAI, M.; DE OLIVEIRA, C. S.; NUNES, M. L.; NARAIN, N. Evaluation of bioactive compounds potential and antioxidant activity of brown, green and red propolis from Brazilian northeast region. Food Research International, v. 101, p. 129-138, 2017.
BOTREL, D.A.; DE BARROS FERNANDE, R.V.; BORGES, S.V.; YOSHIDA, M. I. Influence of wall matrix systems on the properties of spray-dried microparticles containing fish oil. Food Research International, v. 62, p. 344–352, 2014.
BRUSCHI, M. L.; CARDOSO, M. L. C.; LUCCHESI, M. B.; GREMIÃO, M. P. D. Gelatin microparticles containing propolis obtained by spray-drying technique: preparation and characterization. International Journal of Pharmaceutics, v. 264, p. 45–55, 2003.
ÇAM, M.; IÇYER, N. C.; ERDOGAN, F. Pomegranate peel phenolics:
Microencapsulation, storage stability and potential ingredient for functional food development. LWT - Food Science and Technology, v. 55, p. 117-123, 2014.
COSTA, A. M. M.; NUNES, J. C.; LIMA, B. N. B.; PEDROSA, C.; CALADO, V.; TORRES, A. G.; PIERUCCI, A. P. T. R. Effective stabilization of CLA by
microencapsulation in pea protein. Food Chemistry, v. 68, p. 157–166, 2015.
CUEVAS-BERNARDINO, J. C.; LEYVA-GUTIERREZ, F. M. A.; VERNON-CARTER, E. J.; LOBATO-CALLEROS, C.; ROM, A.; ROMÁN-GUERRERO, A.; DAVIDOV- PARDO, G. Formation of biopolymer complexes composed of pea protein and mesquite gum e Impact of quercetin addition on their physical and chemical stability.
Food Hydrocolloids, v. 77, p. 736-745, 2018.
ELBAZ, N. M.; KHALIL, I. A.; ABD-RABOU, A. A.; EL-SHERBINY, I. M. Chitosan- based nano-in-microparticle carriers for enhanced oral delivery and anticancer activity of propolis. International Journal of Biological Macromolecules, v. 92, p. 254–269, 2016.
FALCÃO, S.; VILAS-BOAS, M.; ESTEVINHO, L. M.; BARROS, C.; DOMINGUES, M. R. M.; CARDOSO, S. M. Phenolic characterization of Northeast Portuguese Propolis: usual and unusual compounds. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 396, p. 887-897, 2010.
GHARSALLAOUI, A.; SAUREL, R.; CHAMBIN, O.; VOILLEY, A. Pea (Pisum sativum, L.) Protein Isolate Stabilized Emulsions: A Novel System for
Microencapsulation of Lipophilic Ingredients by Spray Drying. Food Bioprocess
Technology, v. 5, p. 2211–2221, 2012.
GHORBANZADE, T.; JAFARI, S. M.; AKHAVAN, S.; HADAVI, R. Nano-
encapsulation of fish oil in nano-liposomes and its application in fortification of yogurt.
Food Chemistry, v. 216, p. 146–152, 2017.
GOUIN, S. Microencapsulation. Trends in Food Science & Technology, v. 15, p. 330–347, 2004.
GÓMEZ-ESTACA, J.; GAVARA, R.; HERNÁNDEZ-MUÑOZ, P. Encapsulation of curcumin in electrosprayed gelatin microspheres enhances its bioaccessibility and widens its uses in food applications. Innovative Food Science and Emerging
Technologies, v. 29, p. 302–307, 2015.
MASCHERONI, E.; FIGOLI, A.; MUSATTI, A.; LIMBO, S.; DRIOLI, E.; SUEVO, R.; ROLLINI, M. An alternative encapsulation approach for production of active
chitosan–propolis beads. International Journal of Food Science and Technology, v. 49, p. 1401–1407, 2014.
MASTERS, K. Spray drying handbook. 5th ed., London: Longman Scientific & Technical, p. 725, 1991.
MOSER, P.; TELIS, V. R. N.; NEVES, N. DE A.; GARCÍA-ROMERO, E.; GÓMEZ- ALONSO, S.; HERMOSÍN-GUTIÉRREZ, I. Storage stability of phenolic compounds in powdered BRS Violeta grape juice microencapsulated with protein and
maltodextrin blends. Food Chemistry,v. 214, p. 308–318, 2017.
DO NASCIMENTO, T. G.; SILVA, P. F. DA; AZEVEDO, L. F.; ROCHA, L. G. DA; PORTO, I. C. C. DE M.; MOURA, T. F. A. L.; BASÍLIO-JÚNIOR, I. D.; GRILLO, L. A. M., DORNELAS C. B.; FONSECA E. J. DA S.; OLIVEIRA, E. DE J.; ZHANG, A. T., WATSON, D. G. Polymeric Nanoparticles of Brazilian Red Propolis Extract:
Preparation, Characterization, Antioxidant and Leishmanicidal Activity. Nanoscale
Research Letters, 11:301, 2016, DOI 10.1186/s11671-016-1517-3
NESTERENKO, A.; ALRIC, I.; SILVESTRE, F.; DURRIEU, V. Review. Vegetable proteins in microencapsulation: A review of recent interventions and their
das NEVES, M. V.; DA SILVA, T. M.; LIMA, E. DE; DA CUNHA, E. V.; OLIVEIRA, E. DE. Isoflavone formononetin from red propolis acts as a fungicide against Candida sp. Brazilian Journal Microbiology, v. 47, p. 159–166, 2016.
NORI, M. P.; FAVARO-TRINDADE, C. S.; ALENCAR, S. M.; THOMAZINI, M., BALIEIRO, J. C. C.; CASTILLO, C. J. C. Microencapsulation of propolis extract by complex coacervation. LWT- Food Science Technology, v. 44, p. 429–435, 2011.
NIKAIDO, H. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability barriers and active efflux. Science, v. 264, p. 382–388, 1994.
ORTIZ, S. E. M.; MAURI, A.; MONTERREY-QUINTERO, E. S.; TRINDADE, M. A.; SANTANA, A. S.; FAVARO-TRINDADE, C. S. Production and properties of casein hydrolysate microencapsulated by spray drying with soybean protein isolate. LWT -
Food Science and Technology, v. 42, p. 919–923, 2009.
PATEL, J.; KETKAR, S.; PATIL, S.; FEARNLEY, J.; MAHADIK, K. R.; PARADKAR, A. R. Potentiating antimicrobial efficacy of propolis through niosomal-based system for administration. Integrative Medicine Research, v. 4, p. 94–101, 2015.
PEANPARKDEE, M.; IWAMOTO, S.; BOROMPICHAICHARTKUL, C.; DUANGMAL, K., YAMAUCHI, R. Microencapsulation of bioactive compounds from mulberry (Morus alba L.) leaf extracts by protein–polysaccharide interactions. International
Journal of Food Science and Technology, v. 51, p. 649–655, 2016.
PIERUCCI, A. P. T. R.; ANDRADE, L. R.; BAPTISTA, E. B.; VOLPATO, N. M.;
ROCHA-LEÃO, M. H. M. New microencapsulation system for ascorbic acid using pea protein concentrate as coat protector. Journal of Microencapsulation, v. 23, n. 6, p. 654–662, 2006.
PIERUCCI, P. T. R.; ANDRADE, L. R.; FARINA, M.; PEDROSA, C.; ROCHA-LEÃO, M. H. M. Comparison of α-tocopherol microparticles produced with different wall materials: pea protein a new interesting alternative. Journal of Microencapsulation, v. 24, n. 3, p. 201–213, 2007.
PREMIA, M.; SHARMA, H. K. Effect of different combinations of maltodextrin, gum arabic and whey protein concentrate on the encapsulation behavior and oxidative stability of spray dried drumstick (Moringa oleifera) oil. International Journal of
ROCHA, G. A.; FÁVARO-TRINDADE, C. S.; GROSSO, C. R. F. Microencapsulation of lycopene by spray drying: Characterization, stability and application of
microcapsules. Food and Bioproducts Processing, v. 90, p. 37–42, 2012.
ROSSETO, H. C.; DE TOLEDO, L. DE A. S.; DE FRANCISCO, L. M. B.; ESPOSITO, E., LIM, Y.; VALACCHI, G.; CORTESI, R., BRUSCHI, M. L. Nanostructured lipid systems modified with waste material of propolis for wound healing: Design, in vitro and in vivo evaluation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 158, p. 441–452, 2017.
ROY, F.; BOYE, J. I.; SIMPSON, B. K. Review. Bioactive proteins and peptides in pulse crops: Pea, chickpea and lentil. Food Research International, v. 43, p. 432– 442, 2010.
SHANG-JUNG, Y.; JIA-JIUAN, W.; YUAN-CHUEN, W.; CHIH-FENG, H.; TZONG- MING, W.; CHWEN-JEN, S.; CHIEH-MING, J. C. Encapsulation of propolis
flavonoids in a water soluble polymer usingpressurized carbon dioxide anti-solvent crystallization. Journal of Supercritical Fluids, p. 94, v. 138–146, 2014.
SILICI, S.; KUTLUCA, S. Chemical composition and antibacterial activity of propolis collected by three different races of honeybees in the same region. Journal of
Ethnopharmacology, v. 99, p. 69-73, 2005.
DA SILVA, F. C.; DA FONSECA, C. R.; DE ALENCAR, S. M.; THOMAZINI, M., BALIEIRO, J. C. DE C.; PITTIA, P.; FAVARO-TRINDADE, C. S. Assessment of production efficiency, physicochemical properties and storage stability of spray-dried propolis, a natural food additive, using gum Arabic and OSA starch-based carrier systems. Food and Bioproducts Processing, v. 91, p. 28–36, 2013.
SILVA, J. C.; RODRIGUES, S.; FEÁS, X.; ESTEVINHO, L. M. Antimicrobial activity, phenolic profile and role in the inflammation of propolis. Food and Chemical
Toxicology, 50, 1790–1795, 2012.
SINGLETON, V. L.; ORTHOFER, R.; LAMUELA-RAVENTOS, R. M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. Methods in Enzymology, v. 299, p. 152-178, 1999.
SIRIPATRAWAN, U.; VITCHAYAKITTI, W. Improving functional properties of chitosan films as active food packaging by incorporating with propolis. Food
STONE, A. K.; KARALASH A.; TYLER, R. T.; WARKENTIN, T. D.; NICKERSON, M. T. Functional attributes of pea protein isolates prepared using different extraction methods and cultivars. Food Research International, v. 76, p. 31–38, 2015.
TAMM, F.; HERBST, S.; BRODKORB, A.; DRUSCH, S. Functional properties of pea protein hydrolysates in emulsions and spray-dried microcapsules. Food
Hydrocolloids, v. 58, p. 204-214, 2016.
TIVERON, A. P.; ROSALEN, P. L.; FRANCHIN, M.; LACERDA, R. C. C.; BUENO- SILVA, B.; BENSO, B.; DENNY, C.; IKEGAKI, M.; DE ALENCAR, S. M. Chemical Characterization and Antioxidant, Antimicrobial, and Anti-Inflammatory Activities of South Brazilian Organic Propolis. PLoS ONE, v. 11 (11), 2016.
doi:10.1371/journal.pone.0165588
ZANCANELA, D. C.; HERCULANO, R. D.; FUNARI, C. S.; MARCOS, C. M.; ALMEIDA, A. M. F.; GUASTALDI, A. C. Physical, chemical and antimicrobial implications of the association of propolis with a natural rubber latex membrane.
5 Capitulo 3: Produção de micropartículas de extrato de própolis com proteína