Atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical ABTS•+

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.5. Análises química e biológicas do extrato de própolis, fases da digestão e frações do

3.5.3. Atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical ABTS•+

A atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical ABTS^•+ foi feita de acordo com o procedimento descrito por Al-Duais et al. (2009). Para geração da solução-mãe do radical ABTS^•+, foi acrescentado 88µL de persulfato de potássio 140mM em 5ml de solução ABTS 7mM, deixando reagir ao abrigo de luz por 24 horas. Após esse período, a solução trabalho do radical ABTS^•+ foi preparada com a diluição da solução mãe em tampão fosfato de potássio (75mM e pH 7.4) corrigida para uma absorbância de 0.7±0.02 à 734nm.

Na sequência, em cada poço da microplaca foram adicionados 220 μL da solução-trabalho ABTS^•+ e 20 μL dos extratos a serem analisados (EEP, fases da digestão e frações do transporte epitelial). Na sequência, a placa foi agitada e mantida ao abrigo de luz durante 6 minutos. A absorção foi medida em uma leitora de microplacas à 734 nm. Foi feita uma curva analítica padrão utilizando diluições de Trolox (12,5-200mM) e os resultados de cada amostra foram feitos em triplicata e expressos em mg TEAC/g de extrato de própolis.

3 .5 .4 . 3.5.4. Atividade antioxidante pelo método de redução do ferro (FRAP – Ferric

Reducing Antioxidant Power)

A atividade antioxidante pelo método de redução do ferro foi realizada de acordo com a metodologia proposta por Kukic et al. (2008), com algumas modificações para análise em leitora de microplacas. A análise consiste em através dos compostos antioxidantes (redutores) presentes na amostra a ser testada, reduzirem o complexo Fe³⁺/TPTZ (tripiridiltrazina) formado na reação da análise, em Fe²⁺/TPTZ com condições de meio acidificado. Essa reação resulta em uma coloração azul intensa podendo ser detectada por absorbância à 595nm em leitora de microplacas. O reagente FRAP foi preparado no momento da análise através da mistura de 25 ml de tampão acetato (300mM e pH 3.6), 2.5ml da solução TPTZ (10mM de TPTZ em 40mM de HCl) e 2.5ml de FeCl₃ (20mM) em solução aquosa. Em cada poço da microplaca foram adicionados 20 µL da amostra a ser testada, sendo elas EEP, fases da digestão (gástrica e intestinal) e frações do transporte epitelial (apical e basolateral), 30µL de água destilada e 200µL do reagente FRAP. A placa foi incubada à 37°C por 30 minutos e então realizada a leitura de absorbância à 595nm. Para realização de uma curva analítica padrão utilizou-se diluições de sulfato ferroso (SF) (100-700µM) e os resultados das amostras, feitos em triplicata, foram expressos em mg de SF/g de extrato de própolis.

3 .5 .5 . 3.5.5. Atividade antioxidante online por CLAE-FR com o radical ABTS^•+

A análise foi realizada de acordo com a metodologia proposta por (Koleva; radical reagiu com os compostos presentes nas amostras analisadas, separados pós-coluna cromatográfica durante aproximadamente 1 minuto. As amostras submetidas à essa análise foram o EEP, fases gástrica e intestinal e frações apical e basolateral. Todas as amostras foram filtradas em filtro de 0,22µm antes da injeção de alíquotas de 40µL no cromatógrafo.

A reação ocorreu da seguinte forma: os compostos separados por cromatografia líquida de alta eficiência foram primeiramente detectados pelo detector de arranjo de fotodiodo (DAD – SPD-M10AVp, Shimadzu Co). Após a eluição desses compostos da coluna cromatográfica ODS – A (Fase Reversa-18, de 4,6 x 250mm, com partículas no tamanho de 5µm) a reação com o radical ABTS^•+ ocorreu no coil (15m x 0.25mm i.d. PEEK tubing). A

análise da perda da coloração azul do radical, em consequência da intensidade do sequestro destes pelos compostos, foi detectada por um detector de UV-Vis (SPD-20 AV, Shimadzu Co) à 734nm, resultando na formação de picos negativos.O método utilizado para realização do perfil cromatográfico foi proposto por Tiveron (2015) e consistiu no uso da fase móvel A:

água/ácido acético (95,5%/0,5% v/v) e fase móvel B: metanol 100%. A corrida teve o total de 120min e o gradiente de eluição aumentou gradativamente conforme a tabela 1:

Tab ela 1. Tabela 1: Gradiente de eluição utilizado para cromatografia líquida de alta eficiência – fase

reversa

Gradiente Fase A Gradiente Fase B Tempo inicial Tempo final

70% 30% 0 min 15 min calibração com concentrações entre 12,5 a 200mM.

3 .5 .6 . 3.5.6. Sequestro do radical peroxila (ROO^•)

A capacidade de sequestro do radical peroxila (ROO^•) foi determinada monitorando-se o efeito dos extratos no decaimento da fluorescência, gerada pela oxidação da sonda

“fluoresceína” induzida pela presença do radical ROO^•, de acordo com a metodologia descrita por Melo et al. (2015).Inicialmente foi preparada uma solução da sonda fluoresceína 508,25nM em tampão fosfato de potássio (75mM e pH 7.4), e solução de 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 76mM também em tampão fosfato de potássio (75mM e pH 7.4).

Para a reação, em cada poço da microplaca foram adicionados 20µL da amostra a ser analisada (EEP, fases gástrica e intestinal e fração basolateral), 60µL da solução de fluoresceína 508,25nM e 110µL de AAPH 76mM. A leitora de microplacas SpectraMax M3 (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA, USA) foi ajustada a 37°C para realização da

leitura. A mesma foi ajustada para o modo cinética, sendo as leituras realizadas a cada minuto, durante duas horas, em modo fluorescência, com emissão de 528nm e excitação de 485nm. Foi utilizada uma curva padrão de Trolox (12,5-400mM), sendo os resultados expressos em µmol Trolox/mg extrato. As amostras foram analisadas em triplicata.

3 .5 .7 . 3.5.7. Sequestro do ácido hipocloroso (HOCl)

A capacidade de sequestro do ácido hipocloroso (HOCl) foi determinada pelo monitoramento do efeito dos extratos sobre a oxidação de dihidrorodamina (DHR) para rodamina 123, induzida pelo ácido hipocloroso, como o descrito por Melo et al.

(2015).Inicialmente foi preparado o HOCl utilizado na reação com uma solução de 1% de cloreto de sódio (NaOCl) ajustada para um pH 6.2 através do uso de ácido sulfúrico 10%

(H₂SO₄). Para correção da concentração da solução de HOCl, utilizou-se tampão fosfato (100mM e pH 7.4) e a medida de absorbância à 235nm utilizando a absorbtividade molar de 100 M^-1 cm^-1 para cálculo, objetivando a obtenção de uma solução de 5µM de HOCl (solução trabalho) pela lei de Lambert-Beer. A sonda de DHR foi diluída no momento da análise para a concentração de 1.25µM utilizando tampão fosfato (100mM e pH 7.4).Para a análise, foram testadas diversas diluições das amostras (EEP, fases gástrica e intestinal e fração basolateral) adicionadas aos poços da microplaca, juntamente com tampão fosfato (100mM e pH 7.4), DHR 1.25µM e HOCl 5µM. Por meio da leitora de microplacas SpectraMax M3 (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA, USA), com temperatura ajustada à 37°C, no modo fluorescência e comprimentos de onda de emissão 528nm e excitação 485nm, a leitura foi feita imediatamente após a adição de todas as soluções nos poços da microplaca, totalizando 300µL por poço. Os resultados, em triplicata, foram expressos em IC₅₀(mg/mL).

3 .5 .8 . 3.5.8. Ensaio de sequestro do radical superóxido (O2

•-)

O radical superóxido (O₂^•-) foi gerado pelo sistema NADH/PMS. A capacidade de sequestro do O₂^•- foi determinada pelo monitoramento do efeito dos extratos sobre a redução do nitroazul de tetrazólio (NBT), formado pelo radical superóxido, de acordo com Melo et al.

(2015). Inicialmente foi preparada uma solução tampão fosfato de potássio (19mM e pH 7.4).

Os seguintes reagentes, nas determinadas concentrações, foram diluídos no tampão fosfato de

potássio para uso no ensaio de sequestro do radical superóxido: nicotinamida adenina dinucleiotídeo (NADH) (166µM), NBT (107,5µM), fenazina metassulfato (PMS) (2,7µM).As amostras analisadas (EEP, fase gástrica, intestinal e fração basolateral) também foram diluídas em tampão fosfato de potássio em diferentes concentrações. Os reagentes e as amostras foram pipetadas em microplaca totalizando 300µL por poço.Utilizando uma leitora de microplacas SpectraMax M3 (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA, USA), com temperatura ajustada à 25°C, e após 5 minutos de reação dos compostos na microplaca ao abrigo de luz, foi feita a leitura no modo de absorbância à 560nm.Os resultados, em triplicata, foram expressos em IC₅₀(mg/mL).

3 .6 . 3.6. Ensaio de Toxicidade com Galleria mellonella

Os ensaios de toxicidade utilizando o modelo in vivo de G. mellonella foram conduzidos de acordo com o descrito por Sardi et al. (2017). Para determinação da dose letal que mata 50% dos organismos (DL50), foram selecionadas 5 diluições do extrato etanólico liofilizado de própolis (diluídas em etanol 57,5%), nas seguintes concentrações: 10, 20, 25, 35 e 40 mg/ml e também a fase intestinal da digestão sem diluição.Para cada diluição do EEP (5 diluições), fase intestinal (bruta) e controle (etanol 57,5%), foram selecionadas aleatoriamente 10 larvas de G. mellonella com pesagem entre 0.2 e 0.3g, sem sinais de melanização. O experimento foi conduzido em triplicata.

Foram injetados 10µL dos extratos analisados ou controle de etanol na hemocele abdominal (cavidade corporal presente em insetos da ordem Lepidoptera, onde ocorre o fluxo sanguíneo) das larvas de G. mellonella através da última pseudopata esquerda, com o auxílio de uma seringa Hamilton de 25µL (Hamilton, Reno, NV). As larvas foram incubadas em estufa à 30°C e monitoradas para contagem de sobrevivência após 24h, 48h e 72h. As larvas que não apresentavam movimentos ao toque, e que estavam completamente melanizadas, foram consideradas mortas.

3 .7 . 3.7. Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas através do software R Core Team (2020) x64 versão 4.0.3. Os dados foram analisados utilizando análise de variância (ANOVA) e teste Tukey para comparação de médias, ao nível de 5% de significância.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4 .1 . 4.1. Composição química do EEP da PO1

Foram identificados 10 compostos fenólicos no extrato etanólico bruto da PO1, por meio da técnica de espectrometria de massas LC-ESI-QTOF-MS (Tabela 2).

Tab ela 2. Tabela 2. Compostos identificados por LC-ESI-QTOF-MS do extrato de própolis orgânica do

tipo 1 não digerido.

5 (+)-Lariciresinol 18,4 359,1529

160 (100); 175 (Balajaponina D, (-)-secoisolariciresinol, (+)-lariciresinol, matairesinol e (+)- pinoresinol), dois caracterizam-se como sendo precursores de lignanas (álcool coniferil e aldeído coniferil), dois ácidos fenólicos (ácido cafeico e ácido p-cumárico) e um flavonoide (pinobanksina-3-O-acetato).

4 .1 .1 . 4.1.1. Lignanas e precursores de lignanas

O composto 1 gerou o íon precursor m/z 359,1531 [M-H]^- e foi caracterizado como Balajaponina-D de acordo com o padrão obtido do composto nas mesmas condições em que o extrato de própolis foi submetido ao espectrômetro de massas (LC-ESI-QTOF-MS). A identificação foi realizada a partir da fragmentação do composto que gerou o fragmento iônico de m/z 296 no espectro MS². O composto balajaponina-D é proveniente da espécie de planta Balanophora japonica, que assim como outras plantas do mesmo gênero, demonstram efeitos na inibição do HIV, tratamento de hemorroidas, hemoptise e dores de estômago. Além disso, apresentam-se como potenciais antioxidantes na presença de radicais livres(WANG et al., 2012).

O álcool coniferil (composto 2) foi caracterizado pelo íon molecular m/z 179,0729 [M-H]^- e fragmento majoritário m/z 146 no espectro MS²(DAI et al., 2017). Aldeído coniferil (composto 3 com [M-H]^-m/z 177,0571) foi caracterizado por tentativa através do fragmento majoritário m/z 162 (TSUGAWA et al., 2019). Ambos os compostos precursores de lignanas demonstraram alta atividade antioxidante contra os radicais ABTS conforme elucidado em Tiveron et al. (2020). O composto álcool coniferil, estudado por Lee et al. (2004) apresentou alto potencial em sequestrar o radical livre superóxido. Sendo assim, estes são importantes compostos para representarem o notório caráter antioxidante proveniente do extrato etanólico de própolis orgânica do tipo 1.

O composto (-)-secoisolariciresinol (composto 4, [M-H]^- m/z 361,1684) foi identificado por tentativa através do fragmento majoritário m/z 165 (EKLUND et al., 2008;

EKPO et al., 2020; SEUKEP et al., 2020). (+)-lariciresinol (composto 5, [M-H]^- m/z 359,1529) foi identificado por tentativa através do fragmento majoritário m/z 160 (EKLUND et al., 2008). Matairesinol (composto 6, [M-H]^- m/z 357,1375) foi identificado por tentativa pelo fragmento majoritário m/z 122(EKLUND et al., 2008; HANHINEVA et al., 2012). E por fim, o composto (+)-pinoresinol (composto 7, [M-H]^-m/z 357,1378) foi também identificado por tentativa através do fragmento majoritário m/z 151(MORENO-GONZÁLEZ; JUAN;

PLANAS, 2020).

Estudos apresentaram resultados bastante promissores em relação aos efeitos protetivos desenvolvidos pelo consumo de alimentos ricos em lignanas (SOLEYMANI et al., 2020). De acordo com Bajpai et al. (2017), o composto (+)-lariciresinol possui o mesmo mecanismo antioxidante para sequestro de radicais livres do composto secoisolariciresinol,

pois ambos possuem similaridades nas posições químicas dos anéis benzênicos responsáveis pelo desenvolvimento dessas atividades (Figura 5).

F ig ura 3 . Figura 5: Estruturas Químicas das lignanas (1) (+)-lariciresinol e (2) (-)-secoisolariciresinol.

Fonte: PubChem

Os compostos balajaponina D, (-)-secoisolariciresinol, (+)-lariciresinol e matairesinol são considerados marcadores da própolis orgânica PO1, pois nunca foram encontrados em nenhum outro tipo de própolis, segundo Tiveron et al. (2020).

4 .1 .2 . 4.1.2. Ácidos Fenólicos

O ácido cafeico (composto 8, [M-H]^-m/z 179,0368) foi caracterizado por tentativa através do fragmento majoritário em MS² m/z 135, referente à perda de um grupo CO₂ ([M-H-44]^-)(RINI VIJAYAN; RAGHU, 2019). O ácido p-cumárico (composto 9, [M-H]^- m/z 163,0415), foi caracterizado por tentativa através do fragmento majoritário m/z 119 no espectro MS², que se refere à perda do grupo CO₂ da porção do ácido carboxílico (CASTRO et al., 2014; GARDANA et al., 2007).

O ácido p-cumárico possuí a capacidade de se diferenciar em outros ácidos hidroxicinâmicos (como o ácido cafeico) em decorrência de reações químicas como metilação e hidroxilação, podendo com isso aumentar o potencial antioxidante da matriz alimentar. Esse aumento está diretamente relacionado com o número de hidroxilas presentes na estrutura

química do composto, sendo assim, o ácido cafeico, que possuí 2 hidroxilas (OH·), apresenta maior potencial antioxidante que o ácido p-cumárico, que possuí apenas uma (MASEK;

CHRZESCIJANSKA; LATOS, 2016)

Outra característica do ácido p-cumárico é a de gerar monolignóis que ao se dimerizarem formam lingnanas como por exemplo o pinoresinol e matairesinol (PETERSON et al., 2010), compostos que também foram encontrados no extrato etanólico de PO1.

4 .1 .3 . 4.1.3. Flavonoides

O composto Pinobanksina-3-O-acetato (composto 10, [M-H]^-m/z 313,0740), foi identificado por tentativa através do fragmento majoritário m/z 253 no espectro MS² (FALCÃO et al., 2013). Esse mesmo composto foi observado por Sun et al. (2015) em grande quantidade em uma própolis chilena, representando cerca de um terço do total de compostos fenólicos presentes no perfil. Também pôde ser identificado por Park et al. (2004) na própolis verde e em extratos da matriz vegetal Baccharis dracunculifolia que produz a resina que origina esse perfil de própolis. Também foi relatado por Bankova; De Castro; Marcucci (2000) em própolis de álamo (Populus ssp.) de regiões da Europa, Ásia e América do Norte.

Sendo assim, pode-se afirmar que a Pinobanksina-3-O-acetato é um composto comumente encontrado em diversos tipos de própolis.

4 .2 . 4.2. Transporte epitelial de fenólicos da PO1 em monocamadas de células Caco-2

O ensaio de transporte epitelial foi realizado utilizando uma diluição de 1:50 da fração bioacessível (fase intestinal obtida na digestão in vitro), que mostrou ser a maior concentração que não afetou a viabilidade celular, segundo o resultado do ensaio do MTT (item 3.4.3.).

O experimento foi validado através da medição da resistência da monocamada das células Caco-2, antes e após o transporte (TER > 165 Ω cm²) (HUBATSCH;

RAGNARSSON; ARTURSSON, 2007). As resistências obtidas antes do experimento apresentaram em média TER de 288,20±31,01 Ω cm² e após o experimento uma média de TER de 249,06±19,93 Ω cm².

4 .3 . 4.3. Análises Químicas do extrato da própolis e frações digeridas

As análises de composição fenólica, perfil cromatográfico e atividades antioxidantes foram realizadas com o extrato não digerido da própolis orgânica do tipo 1, frações gástrica, bioacessível (intestinal) e do transporte epitelial. Sendo assim, foi possível observar o comportamento da matriz alimentar durante o processo digestivo, no que diz respeito à estabilidade dos compostos e manutenção da atividade antioxidante.

4 .3 .1 . 4.3.1. Perfil Cromatográfico e Atividade Antioxidante on-line

Conforme se pode observar nos cromatogramas obtidos por HPLC do extrato de própolis nãodigerido (Figura 6), os compostos 2, 3, 4 e 8 (álcool coniferil, aldeído coniferil, (-)-secoisolariciresilnol e ácido cafeico) apresentaram picos negativos, os quais correspondem a capacidade para desativar o radical ABTS^•+.

F ig ura 4 . Figura 6: Cromatograma do EEP obtido em HPLC-DAD com ABTS online acoplado (picos

negativos), com compostos identificados por comparação com o LC-ESI-QTOF-MS, à 260nm. (1) balajaponina D; (2) álcool coniferil; (3) aldeído coniferil; (4)

(-)-secoisolariciresinol; (5) lariciresinol; (6) matairesinol; (7) (+)-pinoresinol; (8) ácido cafeico;

(9) ácido p-cumárico; (10) pinobanksina-3-O-acetato.

Essa diferença na interação e atividade dos compostos com o radical ABTS^•+é decorrente da estrutura química destes. Ou seja, devido ao fato do radical ABTS^•+ possuir carga positiva alguns compostos conseguem interagir mais facilmente, desenvolvendo maior atividade antioxidante de sequestro deste radical devido à afinidade elétrica desenvolvida entre as estruturas químicas (SPAGNOL et al., 2019). Entretanto, alguns compostos que não possuem a capacidade de interagir e sequestrar o radical ABTS^•+ não são descartados quanto ao potencial antioxidante, pois estes podem interagir com outros tipos de radicais que tenham outras conformações químicas e consequentemente maior afinidade.

Na tabela 3 estão mostrados os valores de atividade antioxidante, calculadas por meio de curva de Trolox. Esses resultados corroboram com os observados por Tiveron et al.

(2020), que ao analisarem cada composto isoladamente, concluíram que o aldeído coniferil, álcool coniferil e o (-)-secoisolariciresinol apresentaram altas atividades de sequestro do radical ABTS^•+ (6.96±0.07; 9.24±0.36 e 3.53±0.05 µmol de TEAC/mg respectivamente).

Tab ela 3. Tabela 3: Atividade antioxidante utilizando curva de calibração de padrões de Trolox.

N° do

4 (-)-Secoisolariciresinol 188,16 14,42

8 Ácido cafeico 431,39 129,89

*composto identificado por tentativa (LC-ESI-QTOF-MS)

**valores obtidos por ABTS online na forma de picos negativos, com ajuste de área baseado na curva de calibração feita com Trolox e expressos em equivalente ao trolox (TEAC), µM.

Número dos picos se refere a Figura 6.

Após a digestão e o transporte epitelial do extrato etanólico liofilizado da PO1, foram traçados os perfis cromatográficos de cada fase obtida para verificação dos compostos presentes e suas respectivas atividades antioxidantes de sequestro do radical ABTS^•+ (Tabela 4).

Os compostos que apresentaram alta capacidade de sequestro do radical ABTS^•+ nas frações digeridas foram o ácido cafeico, álcool coniferil, aldeído coniferil e (-)-secoisolariciresinol, os quais foram identificados por tentativa. Entretanto, esses compostos

não puderam ser encontrados na fração basolateral obtida após o processo de transporte epitelial da fase bioacessível (Tabela 4).

Tab ela 4. Tabela 4: Atividade antioxidante contra o radical ABTS^•+utilizando a técnica de HPLC

on-line das diferentes fases obtidas no ensaio de digestão e transporte epitelial do extrato liofilizado da própolis orgânica do tipo 1.

N°

1 ni** 243,54±12,20 173,53±42,41 111,63±23,45 115,73±29,03 2 Ácido cafeico* 399,72±24,52 129,12±31,94 5,22±0,32 -

Apesar disto, foram observadas em todas as etapas da digestão in vitro, pelo método de atividade antioxidante on-line, a presença de outros compostos que apresentaram atividade antioxidante pelo sequestro do radical ABTS^•+ (Figuras 7 e 8).

F ig ura 5 . Figura 7: Cromatograma e ABTS online da Fase gástrica da digestão in vitro do extrato etanólico liofilizado de própolis orgânica do tipo 1. Numeração se refere a descrita na tabela 4.

F ig ura 6 . Figura 8: Cromatograma e ABTS online da Fase Intestinal (bioacessível) da digestão in vitro do extrato etanólico liofilizado de própolis orgânica do tipo 1. Numeração se refere a descrita na tabela 4.

Apesar de estarem em menor concentração e ausentes no extrato de própolis, foi observada a presença de dois compostos não identificados com atividade antioxidante nas frações digeridas (compostos 1 e 3), os quais foram inclusive absorvidos e transportados pelas células Caco- (Figura 9 e Tabela 4).

F ig ura 7 . Figura 9: Cromatograma e ABTS online da Fração basolateral do Transporte epitelial com Caco-2 da fração bioacessível obtida em ensaio de digestão in vitro do extrato etanólico liofilizado de própolis orgânica do tipo 1. Numeração se refere a descrita na tabela 4.

Uma possível justificativa para não terem sido identificados os precursores das lignanas (álcool coniferil e aldeído coniferil) e lignanas como a(-)-isosecolariciresinol na fase basolateral do transporte epitelial é a de que a maior parte destes compostos sãoconvertidos em enterolignanas, denominadas enterolactona e enterodiol (lignanas de mamíferos) pela microflora intestinal antes de serem absorvidas pelo cólon (SOLEYMANI et al., 2020). Ou seja, há uma mudança na conformação química dos compostos, e o modelo de digestão in vitro utilizado neste estudo não contempla a etapa de biotransformação e atuação dos microrganismos sob os compostos da matriz alimentar presentes na fase intestinal.O modelo de monocamada de células Caco-2 possuí algumas limitações quando comparado aos enterócitos que constituem o epitélio intestinal. Entre as limitações está a baixa permeabilidade paracelular (IFTIKHAR et al., 2020), dificultando a absorção de compostos

que possuem esse tipo de transporte, como é o caso do ácido cafeico. No entanto, foi possível verificar que mesmo após o processo de digestão e transporte, alguns compostos presentes no extrato etanólico da PO1, e com atividade antioxidante, foram absorvidos.

Observa-se também que nem sempre os picos de maior atividade antioxidante correspondem aos picos majoritários do cromatograma. Assim alguns compostos, mesmo que em menor quantidade, mostraram maior capacidade de sequestrar o radical livre ABTS^•+, quando comparados a outros que estão presentes em maiores concentrações (Figuras 7, 8 e 9).

4 .3 .2 . 4.3.2. Teor de fenólicos totais do extrato de própolis e frações digeridas

Após o processo de digestão in vitro e transporte epitelial da fase intestinal obtida, foram feitos ensaios para caracterização das amostras (ELP, fases gástrica e intestinal, frações apical e basolateral) com o intuito de observar e comparar o potencial antioxidante de cada etapa da digestão do extrato de própolis (Figuras 10, 11 e 12). A fase oral não foi levada em consideração para estas as análises pelo fato do extrato de própolis não ser uma matriz rica em carboidratos, não tendo assim alteração pelas enzimas região sublingual (HUR et al., 2011).

F ig ura 8 . Figura 10: Teor de compostos fenólicos totais do extrato de própolis antes e após a digestão

in vitro e transporte epitelial. Colunas acompanhadas com a mesma letra não diferem entre si estatisticamente ao nível de 5% de significância pelo teste Tukey.

Conforme apresentado na Figura 10, houve uma diminuição (aproximadamente 90%) no teor total de compostos fenólicos do extrato de própolis (20.52±1.18 mgEAG/g) e a fração da digestão intestinal (2.16±0.23 mgEAG/g). Entretanto, dentre os compostos fenólicos que

Extrato bruto Fase gástrica Fase Intestinal Fase Apical Fase Basolateral

mgEAG/g

B B B B

estavam biodisponíveis (fase intestinal), houve uma transporte de aproximadamente 84% para a fração basolateral (1.82±0.018 mgEAG/g).

Comportamento semelhante foi observado por Barak et al. (2019), em um estudo de bioacessibilidade com extrato de cranberry europeia, em que houve uma diminuição de aproximadamente 64% no teor de compostos fenólicos totais entre o extrato bruto e a fase intestinal. Cañas et al. (2020) constataram que o conteúdo de compostos fenólicos totais

No documento Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (páginas 31-0)