Na análise da capacidade antioxidante total dos extratos etanólicos de geoprópolis à 50 e 90% (figura 18), observou-se que os extratos de geoprópolis proveniente da abelha Manduri apresentaram níveis elevados da capacidade antioxidante total (2,7 e 2,75 mmol/L, respectivamente). Enquanto que nas amostras das outras duas espécies foram detectados baixos níveis de antioxidantes (Mandaçaia= 0,31 e 0,20 mmol/L e Jataí = 0,24 e 0,21 mmol/L para os extratos 50 e 90%, respectivamente).
Figura 18 – Correlação da atividade antioxidante total com diferentes concentrações dos extratos etanólicos de geoprópolis à 50% (A) e à 90% (B).
mmol/L
mmol/L
A
O quadro 3, resume os valores do rendimento dos extratos de geoprópolis, teor de compostos fenólicos e flavonóides, e atividade antioxidante total (TEAC).
Amostra Rendimento Extração (%) Fenólicos (%) Flavonóides (%) TEAC (mmol/L) Etanol 50% TEAC (mmol/L) Etanol 90% Jataí 80 0,20 ± 0,009 0,0 ± 0,001 0,24 0,21 Mandaçaia 60 1,10 ± 0,04 0,2 ± 0,004 0,31 0,20 Manduri 07 29,0 ± 0,057 0,7 ± 0,047 2,60 2,75 Quadro 3 - Rendimento dos extratos de geoprópolis, teor de compostos fenólicos e flavonóides, e atividade antioxidante total (TEAC).
6 DISCUSSÃO
Para a manutenção da vida nas colmeias das abelhas, a atividade antimicrobiana da própolis e da geoprópolis apresenta papel fundamental, sendo esta devida a efeitos sinérgicos entre os seus diversos componentes químicos, como o teor de flavonóides, de ácidos fenólicos e derivados (BANKOVA et al. 1995; MARCUCCI, 1995; SFORCIN & ORSI, 2005).
Com relação a atividade antimicrobiana, nossos dados mostraram que a geoprópolis produzida pelas abelhas sem ferrão apresentaram atividade antimicrobiana similar aos estudos encontrados na literatura com os extratos etanólicos de própolis da abelha Apis mellifera, os quais relatam uma excelente ação antimicrobiana da própolis frente as bactérias gram-positivas e moderada inibição contra bactérias gram-negativas (MENEZES, 2005; UZEL et al. 2005).
Nesse sentido, Velikova et al. (2000) investigaram a composição química e a atividade antibacteriana de própolis oriundo de abelhas brasileiras, incluindo T.
angustula, Melipona marginata e Melipona quadrifasciata. Segundo eles, os
compostos majoritários encontrados foram os derivados do ácido benzóico, principalmente o acido gálico, além de diterpenos e triterpenos. Esses extratos foram ativos contra Staphylococcus aureus, E. coli e Candida albicans, porém não elucidam o mecanismo de ação antimicrobiana. Além da própolis, alguns autores relataram a atividade antimicrobiana do mel produzido por esta espécie de abelha (MIORIN et al. 2003; TORRES et al. 2004).
O mecanismo de ação antimicrobiana da própolis é complexa e é atribuída ao sinergismo entre os compostos fenólicos e outros componentes presentes na resina (BURDOCK, 1998) e alguns autores sugerem que esses componentes provocam danos na membrana citoplasmática da bactéria, causando assim um aumento na permeabilidade, refletindo na concentração de potássio intracelular (BANKSOTA, TEZUKA & KADOTA, 2001; MIRZOEVA, GRISHANIN & CALDER, 1997; CUSHNIE et al. 2007).
Essa diferença de ação antimicrobiana se deve a diferente constituição da parede celular entre as bactérias gram-negativas e gram-positivas, já que uma das hipóteses sobre a ação dos flavonoides, ácidos e ésteres aromáticos presentes na própolis seja diretamente na estrutura da parede celular bacteriana (VARGAS et al.
2004). Embora a parede celular das bactérias gram-negativas ser menos rígida que as gram-positivas, devido a menor espessura da sua camada de peptideoglicanos, no entanto, a parede celular das gram-negativas são mais complexas quimicamente (presença de lipopolissacarídeo e lipídeos) (VARGAS et al. 2004).
Outros estudos também relatam outros mecanismos de ação da proópolis, como Mirzoeva et al. (1997) que mostram que alguns componentes da própolis alteram a permeabilidade da membrana bacteriana levando a uma diminuição no potencial de membrana devido ao gradiente eletroquímico de prótons através da membrana. Esse mecanismo é essencial para a manutenção da síntese de ATP, do transporte de membrana e para a motilidade bacteriana. Já Cushnie & Lamb (2005) comprovaram que um importante componente químico da própolis, a Galangina, pode induzir a depleção de potássio causando danos na membrana citoplasmática, como o enfraquecimento da parede celular ou a inibição de sua síntese resultando em lise celular.
Interessantemente, em nosso estudo os valores de CIM encontrados para a espécie S. aureus (ATCC) dos extratos de geoprópolis das abelhas Manduri e Jataí foi maior do que aquele encontrado para o S. aureus MRSA. Ou seja, estes extratos apresentaram maior inibição frente à cepa meticilina resistente do que frente à cepa ATCC. Entretanto, tal resultado também foi encontrado por outros autores (ALCARÁZ et al. 2000; ADELMAN, 2005).
A ação antibacteriana frente ao S. aureus MRSA provocada pelos flavonóides é dependente de suas estruturas moleculares, colocando as chalconas como mais efetivas quando comparadas às estruturas das flavonas e flavanonas, já que a região carbonílica da molécula está relacionada a maior atividade anti-MRSA dos flavonóides (ALCARÁZ et al. 2000). Por isso, as diferenças quanti e qualitativas na composição de flavonóides das amostras de geoprópolis podem justificar a excelente ação dos extratos provenientes das abelhas sem ferrão frente a cepa S. aureus MRSA.
Em relação a quantificação dos compostos fenólicos e flavonóides presentes nas geoprópolis, os resultados mostraram que os teores oriundos da abelha Manduri apresentou maiores níveis destes compostos, enquanto as geoprópolis das outras abelhas apresentaram níveis baixos (Mandaçaia) ou não foram detectados (abelha Jataí) tais compostos. De acordo com o Ministério da Agricultura, o valor mínimo exigido para compostos fenólicos em extratos de própolis é de 0,50% (m/m) e 0,25%
para compostos flavonóides (BRASIL, 2001), caracterizando que apenas o extrato proveniente da abelha Jataí estava em desconformidade com a legislação.
Esta variação no teor de compostos fenólicos e flavonóides entre as diferentes própolis já foi evidenciada por outros autores, como Righi et al. (2013) que avaliaram a constituição química de diversos extratos de própolis provenientes de diferentes estados brasileiros e relataram uma constante variação na presença de compostos fenólicos nesses extratos de 0,9% a 27,3%. Dutra (2006) analisou o conteúdo fenólico e de flavonóide de geoprópolis produzidas no Maranhão e obteve resultados entre 1,7% a 31,8% para compostos fenólicos e de 0,17 a 6,0 % para flavonóides. Já Cunha et al. (2009) relataram que os valores de flavonóides e polifenóis totais nos extrativos de geoprópolis de Melipona fasciculata provenientes do mesmo Estado ficaram entre 0,85% a 1,85% e 7,36% a 37,04%, respectivamente.
Esta variação no teor de compostos fenólicos e flavonóides nos diferentes estudos pode ser devido a diferença na época e tempo de coleta da própolis, na vegetação ou no tipo de solo coletado pelas abelhas, uma vez que o método de extração e o solvente extrator utilizado nesse estudo foi o mesmo. Nesse sentido, Cunha et al. (2004) realizaram a avaliação do rendimento dos extratos de própolis frente ao teor de polifenóis variando as soluções extrativas e os métodos de extração. Estes autores observaram que apesar da extração com etanol absoluto proporcionar maior rendimento do teor de sólidos, as soluções etanólicas entre 60 e 80% (V/V) levam a um melhor rendimento no teor de substâncias fenólicas. Em outro estudo, Park et al. (1998) avaliaram o rendimento da própolis verde e concluiu que a solução etanólica a 80% (V/V) é a melhor para extração.
Além disso, Borges & Blochtein (2005) observaram que existe uma diferença nas atividades externas de espécies de abelhas sem ferrão de acordo com as estações do ano, como a atividade de voo e de polinização, o que pode interferir na expressão de metabólicos secundários ativos em resinas, como a geoprópolis, e no mel, bem como na atividade biológica. Isso pode explicar as diferenças nos teores de substâncias fenólicas entre os três extratos analisados, já que os mesmos foram coletados em épocas distintas. Além disso, Park et al. (1998) e Koo & Park (1997) relataram que a ecologia vegetal do local onde a geoprópolis foi coletada e a variabilidade genética das abelhas rainhas podem interferir na composição química desta resina. Stock et al. (2010) afirmaram que o teor de compostos fenólicos é maior nas amostras que apresentam menor tempo de maturação.
Em relação aos constituintes fenólicos, poucos estudos são realizados com a geoprópolis, como os realizados por Miorin et al. (2003) que identificaram componentes da geoprópolis produzida de T. angustula (Jataí) que pudessem estar associados a atividade antimicrobiana, tais como: 3-prenil-4-hydroxicinamico, 3,5- diprenil- 4-hidroxicinamico, 2,2-dimetil-8-prenil-2H-1-benzopirano- 6-propenoico, e um derivado do ácido cinâmico. Além disso, recentemente, Maia et al. (2014) avaliaram por espectrometria de massas, os constituintes presentes na geoprópolis coletada em Prudentópolis e relataram os seguintes compostos fenólicos: ácido 3,4-diidroxi-5- prenil-cinamico; diidrocampferide; ácido 3- prenil-4-hidroxicinamico; ácido (E)-3-{-4- hidroxi-3-[(E)-4-(2,3- diidrocinamoil oxi)-3-metil-2-butenil]-5-prenilfenil}-2- propenoico; isosakuranetina; ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinamico, também conhecido como artepillina C, e campferide.
Por outro lado, Bankova et al. (1998) relataram diferenças na composição química da geoprópolis das abelhas sem ferrão da América do Sul, já que foram encontradas alguns compostos químicos, como aldeídos e alguns tipos de flavonóides, que eram presentes em Melipona sp. e ausentes em Tetragonisca sp.
Uma das principais propriedades atribuídas aos diferentes tipos de própolis e seus compostos fenólicos é a sua capacidade antioxidante, visto que podem eliminar radicais livres (BANSKOTA et al. 1998; CHOI et al. 2006; CABRAL et al., 2009). Em nosso estudo, a atividade antioxidante do extrato da abelha Manduri também foi a que apresentou melhor atividade (2,60 a 2,75 mmol/L), fato que pode ser explicado pelo alto teor de compostos fenólicos e flavonóides encontrados na amostra (MOREIRA et al. 2008). Já os demais extratos apresentaram baixas atividades antioxidantes devido ao baixo teor de polifenóis.
O conteúdo fenólico total está relacionado diretamente com a atividade antioxidante, visto que tais compostos têm sido extensivamente identificados como os antioxidantes mais abundantes e efetivos nas amostras de própolis brasileiras (BANSKOTA et al. 1998; APAK et al. 2007; CABRAL et al. 2009). No entanto, o sinergismo de componentes fenólicos com outros compostos químicos são os responsáveis pela ação antimicrobiana da própolis e geoprópolis (BANKOVA, 2005). Sendo assim, ao correlacionarmos a ação antimicrobiana destes extratos com o teor de substâncias fenólicas, incluindo os flavonóides, nota-se uma boa ação antimicrobiana dos três extratos de geopropolis frente as bactérias gram-positivas, incluindo o S. aureus MRSA. No entanto, a espécie Manduri quando comparada as
outras abelhas, alcançou valores de CIM bem menores frente as bactérias gram- positivas. Pode-se, então, sugerir que os altos valores de substâncias fenólicas presentes no extrato de geoprópolis da Manduri podem estar associados a maior eficácia deste extrato frente a estas bactérias.
Entretanto, a espécie Jataí apresentou valores abaixo do preconizado pelo Ministério da Agricultura para a presença de compostos fenólicos, incluindo os flavonóides, e ainda assim mostrou boa atividade antimicrobiana frente às cepas gram-positivas. Desta forma, pode-se sugerir que o teor dessas substâncias não está relacionado diretamente a ação antimicrobiana do geoprópolis, evidenciando a necessidade de revisão ou inclusão de novos parâmetros para avaliação da qualidade de extratos de geoprópolis das abelhas sem ferrão, visto que a legislação é voltada para os produtos da espécie Apis mellifera, e há um crescente aumento da atividade meliponícula no Brasil. Corroborando, Araújo (2009) correlacionou a atividade de diversos extratos de própolis do Brasil com o teor de substâncias fenólicas e também observou que nem sempre a ação antimicrobiana está relacionada à presença ou mesmo a grande quantidade de flavonóides nas amostras de própolis.
7 CONCLUSÃO
Todas as amostras de geoprópolis utilizadas nesse estudo mostraram atividade antimicrobiana frente às bactérias gram-positivas (E. faecalis, S. aureus e S.
aureus MRSA), sendo que a abelha Manduri apresentou menor valor de CIM e
CBM;
A geoprópolis da abelha Mandaçaia foi a que apresentou moderada atividade antimicrobiana frente as bactérias gram-negativas (E. coli e P. aeruginosa);
A geoprópolis da abelha Manduri foi a que apresentou maior teor de compostos fenólicos e flavonóides, seguido da geoprópolis da abelha mandaçaia, e ambas estavam em conformidade com os parâmetros preconizados da Instrução Normativa n° 3 (2001) do MAPA;
A geoprópolis da espécie Manduri também apresentou elevados níveis de antioxidante total em relação as demais abelhas.
Com isso, neste estudo foi mostrado que a atividade antimicrobiana dos extratos de geoprópolis não está diretamente associada aos elevados níveis de compostos fenólicos, incluindo flavonóides, visto que mesmo em baixos níveis destes compostos, como o geoprópolis da abelha Jataí, foi observada excelente atividade antimicrobiana frente a bactérias gram-positivas. Desta forma, há necessidade da criação de normas específicas que comprovem a eficácia do geoprópolis de espécies de abelhas sem ferrão nas atividades biológicas destes extratos que podem estar relacionadas a outros compostos químicos não fenólicos.
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