OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
4.12 Atividade das caspases-3 e
Para analisar se o [10]-gingerol é capaz de induzir a atividade de caspases, e portanto, da apoptose, células da linhagem 4T1Br4 foram plaqueadas em placas de 6 poços overnight (5.105 células/poço). No dia seguinte, as células foram tratadas com as concentrações de 10, 25 e 50µM de [10]-gingerol por 8 e 18h de incubação. As células foram lisadas com tampão de lise contendo inibidor de proteases (0,2% de Triton X-100 em 0,2M de Tris-HCl, pH 7.4, inibidor de protease Sigma S2711) e quantificadas com kit de detecção colorimétrica BCA (BCA Protein Assay, Pierce). Para quantificar a atividade das caspases foi utilizado os substratos das caspases-3, -7, (AnaSpec, ANAS 60303). No dia da leitura, foram utilizados 20µl de amostra com 90µl de substrato (contendo 10mM HEPES, 20mM, pH 7,35, contendo NaCl 150mM, KCl 5mM, MgSO4 1mM e MnCl2 1mM; 10% Sacarose; 10mM DTT, Ditiotreitol; e substrato AnaSpec 2µl/mL). As amostras foram plaqueadas em triplicata em placa de 96 poços e incubadas por 30min a temperatura ambiente. A leitura foi realizada em leitor de placa (Hidex Chamaleon™ V) a cada 5min por 2h, nos comprimentos de onda de
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460nm de emissão e 365nm de excitação. Para o cálculo da atividade das caspases foi utilizada a seguinte fórmula:
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑠𝑝𝑎𝑠𝑒𝑠 =[𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎] 𝑥 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑎 𝐴𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝜇𝑙)𝑠𝑙𝑜𝑝𝑒 = ∆/𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜
Este experimento foi baseado e modificado dos trabalhos de Gukovskaya et al., Murthy et al. e Yusuf et al. (GUKOVSKAYA et al., 2002; MURTHY et al., 2010; YUSUF et al., 2002).
4.13 Expressão gênica
4.13.1 Tratamento das células e extração do RNA
A expressão de alguns genes relacionados a apoptose foram analisados com relação a atividade do [10]-gingerol. Para isso, 5x105 células da linhagem 4T1Br4 foram plaqueadas em placas de 6cm por 48h. Após este período, as células foram incubadas com o [10]-gingerol por 6 e 18h. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes com PBS estéril e lisadas com reagente Trizol®. O lisado foi armazenado em freezer a -80°C para posterior extração do RNA.
A extração do RNA foi realizada conforme instruções do fabricante. Resumidamente, aos lisados foram adicionados 200µl de clorofórmio e a mistura foi incubada por 15min a temperatura ambiente e em seguida, centrifugada por 15min 12000rpm a 4°C. Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo ao qual foram adicionados 450µl de isopropanol. Estes tubos foram invertidos 10 vezes para homogeneizar a solução e incubados por 10min a temperatura ambiente. Em seguida, os tubos foram centrifugados 10min a 12000rpm por 10min para formação do pellet do RNA. O sobrenadante foi descartado e lavado com 1mL de etanol 70% e centrifugado a 7500rpm a 4°C por 5min. Este processo foi repetido novamente e o pellet formado e seco foi ressuspendido em 20µl de água ultra pura. Antes da síntese de cDNA, o RNA foi quantificado e avaliado sua pureza por nanodrop (Thermo Scientific Nano 2000).
4.13.2 Síntese cDNA
Para a síntese do cDNA foram utilizados 1,5µg de RNA num volume final de 8µl. Em seguida, foi adicionada a mistura de dNTPs (concentração final de 10mM), 1µl de oligo dT
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(0,5µg/µl) seguido de incubação por 10min a 70°C. Percorrido o tempo, foi adicionado 2µl do tampão 10x da enzima, 1µl da enzima M-MLV Reverse Trasncriptase (Sigma M1302) contendo 200 unidades/µl, 1µl de inibidor de RNAse (20 unidades/µl) e 6µl de água ultrapura. Em seguida, a solução foi incubada por 50min a 37°C em banho seco para a síntese do cDNA. Logo após, a reação foi sujeita a uma temperatura de 94°C por 10min para desnaturação da enzima, conforme instruções do fabricante.
4.13.3 Reação de PCR em tempo real e análise
Para análise da expressão gênica de genes associados a apoptose foi utilizado primers pré-desenhados e validados da Sigma (KiCqStart®SYBR® Green Primers) com exceção do gene constitutivo RPS27a. Os genes analisados foram: Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9, Bax e Bcl-2 e suas sequências podem ser verificadas na tabela abaixo:
Tabela 1 –Sequências dos primers utilizados e suas concentrações na reação final da PCR em tempo real.
Nome do gene Sequência (5’-3’) Concentração final do primer na reação de
PCR
Foward Mouse Caspase-3 CATAAGAGCACTGGAATGTC 200nM
Reverse Mouse Caspase-3 GCTCCTTTTGCTATGATCTTC 200nM
Foward Mouse Caspase-7 GTAATGGACTGTGTTGGTTG 200nM
Reverse Mouse Caspase-7 CATCTGGTAACATAAGAAGC 200nM
Foward Mouse Caspase-8 CAAGAGAACAAGACAGTGAG 200nM
Reverse Mouse Caspase-8 ACTCAGAGCCTCTTTATCAC 200nM
Foward Mouse Caspase-9 GACCCTTACGGGGAAAACCAT 200nM
Reverse Mouse Caspase-9 AGACAAAGTCCGGCCATCTTC 200nM
Foward Mouse Bax CCTTTTTGCTACAGGGTTTC 200nM
Reverse Mouse Bax ATATTGCTGTCCAGTTCATC 200nM
Foward Mouse Bcl-2 ATGACTGAGTACCTGAACC 50nM
Reverse Mouse Bcl-2 ATATAGTTCCACAAAGGCATC 50nM
Foward Mouse RPS27a GACCCTTACGGGGAAAACCAT 200nM
Reverse Mouse RPS27a AGACAAAGTCCGGCCATCTTC 200nM
Para a reação de PCR foi utilizado o Sybr Green da Sigma (SYBR®Green JumpStart™Taq ReadyMix) e os componentes da reação estão descritos na tabela abaixo, assim como a reação na Figura 15.
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Tabela 2 – Componentes da PCR.
Reação de PCR em tempo real
Sybr Green 5µl
Primers (Foward + Reverse) 1µl
Água 2,7µl
cDNA (10ng) 1,3µl
Figura 15 – Ciclo da Reação de PCR em tempo real.
Para as reações foi utilizado termociclador da BioRad (CFX96 BioRad) conforme reação descrito acima, através da análise do Ct das amostras (“Cycle Threshold”). Nesta análise, foi realizado o ΔCt (Ct do gene alvo menos o Ct gene constitutivo). Em seguida, foi realizado o cálculo do ΔΔCt (ΔCt das amostras menos a média do ΔCt das amostras controles, nesse caso foi utilizado as amostras sem tratamento do [10]-gingerol). Os dados foram então analisados utilizando a seguinte fórmula: 2-ΔΔCт, representando em unidades arbitrárias a expressão gênica dos genes alvos com relação a expressão do gene constitutivo (RPS27a) (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
4.14 Modelos in vivo de metástase
Ensaios in vivo utilizando modelos de formação de metástase espontânea e experimental foram realizados em colaboração com o Dr. Normand Pouliot do Laboratório de Metástase situado no Hospital PeterMacCallum Cancer Centre, Melbourne, Austrália. Além disso, o modelo também foi desenvolvido no laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (Departamento de Ciências Fisiológicas – UFSCar) em colaboração com a Dra Rebeka Tomasin do laboratório de Nutrição e Câncer dirigido pela Profa Dra Maria Cristina Cintra
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Gomes Marcondes (UNICAMP) e com o laboratório de Neuroendocrinologia dirigido pela Profa Dra Keico Okino Nonaka.
Os animais utilizados foram camundongos fêmeas Balb/c com idade de 6 a 8 semanas. Estes animais foram adquiridos no Hospital Peter MacCallum e no Biotério da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), sob autorização do comitê de ética de número (E507, CEUA 3224-1, respectivamente). Os animais foram mantidos em biotério com temperatura controlada de 22°C±2, água e ração ad libtum.