A partir do resultado pelo ensaio de atividade fibrinogenolítica, foi possível observar uma degradação da cadeia Aα do fibrinogênio a partir de 60 minutos no tratamento com extrato de folhas infiltradas com rBPSP-I por meio dos subprodutos da banda α do fibrinogênio, algo que não foi observado nos tratamentos com o material selvagem, conforme pode ser visto na Figura 14.
Figura 14: Atividade Fibrinogenolítica da rBPSP-I. A: Atividade fibrinogenolítica por 5 minutos de incubação do controle negativo. B: Atividade fibrinogenolítica por 10 minutos
de incubação do controle negativo. C: Atividade fibrinogenolítica por 30 minutos de incubação do controle negativo. D: Atividade fibrinogenolítica por 60 minutos de incubação
controle negativo. F: Fibrinogênio controle. G: Atividade fibrinogenolítica por 5 minutos de incubação da rBPSP-I. H: Atividade fibrinogenolítica por 10 minutos de incubação da rBPSP-
I. I: Atividade fibrinogenolítica por 30 minutos de incubação da rBPSP-I. J: Atividade fibrinogenolítica por 60 minutos de incubação da rBPSP-I. K: Atividade fibrinogenolítica por
120 minutos de incubação da rBPSP-I. MM: Padrão de Massa Molecular em kDa.
6 CONCLUSÃO
Através dos resultados obtidos, pode-se afirmar que foi possível realizar a transformação das bactérias e R. radiobacter com o gene codificante da serinoprotease thrombin-like derivada da peçonha de B. pauloensis (rBPSP-I) possibilitanto a posterior agroinfiltração. Houve a confirmação da expressão de uma proteína detectada no western-blot apenas no material extraído das folhas transformadas com a construção rBPSP-I e ausente no material controle. No entanto, a massa molecular observada é divergente da esperada teórica para a proteína estudada necessitando assim de experimentos futuros para a confirmação da identidade desta.
Foi possível realizar o estudo de funcionalidade parcial através da análise da atividade fibrinogênolítica da rBPSP-I, presente nos extratos proteicos infiltratros e ausente no material controle.
Como experimentos futuros, torna-se necessária a confirmação da identidade da proteína expressa bem como, a realização de novos ensaios funcionais de sua atividade.
7 REFERÊNCIAS
Agrobacterium tumefaciens – Plant Parasites of Europe. Disponível em:
<https://bladmineerders.nl/parasites/bacteria/proteobacteria/rhizobiales/agrobacterium/agroba cterium-tumefaciens/>. Acesso em: 1 set. 2020.
ALAPE-GIRÓN, A. et al. Snake Venomics of the Lancehead Pitviper Bothrops asper : Geographic, Individual, and Ontogenetic Variations. Journal of Proteome Research, v. 7, n. 8, p. 3556–3571, ago. 2008.
BARBO, F. E. et al. Another new and threatened species of lancehead genus Bothrops (Serpentes, Viperidae) from Ilha dos Franceses, Southeastern Brazil. Zootaxa, v. 4097, n. 4, p. 511–529, 4 abr. 2016.
BERNARDE, P. S. Mudanças na classificação de serpentes peçonhentas brasileiras e suas implicações na literatura médica. p. 9, 3 jan. 2011.
BOCHNER, R.; STRUCHINER, C. J. Epidemiologia dos acidentes ofídicos nos últimos 100 anos no Brasil: uma revisão. Cadernos de Saúde Pública, v. 19, n. 1, p. 07–16, fev. 2003.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, n. 1, p. 248–254, 7 maio 1976.
BRAUD, S.; BON, C.; WISNER, A. Snake venom proteins acting on hemostasis. Biochimie, v. 82, n. 9, p. 851–859, 10 set. 2000.
BRETTHAUER, R. K.; CASTELLINO, F. J. Glycosylation of Pichia pastoris -derived proteins. Biotechnology and Applied Biochemistry, v. 30, n. 3, p. 193–200, 1999.
CAIO, V. M. et al. Genética comunitária e hemofilia em uma população brasileira. Cadernos de Saúde Pública, v. 17, n. 3, p. 595–605, jun. 2001.
CASEWELL, N. R. et al. Medically important differences in snake venom composition are dictated by distinct postgenomic mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 111, n. 25, p. 9205–9210, 24 jun. 2014.
CHEN, M.-H. et al. Signal Peptide-Dependent Targeting of a Rice α-Amylase and Cargo Proteins to Plastids and Extracellular Compartments of Plant Cells. Plant Physiology, v. 135, n. 3, p. 1367–1377, 1 jul. 2004.
CIRCELLI, P. et al. Efficient Agrobacterium-based transient expression system for the production of biopharmaceuticals in plants. Bioengineered Bugs, v. 1, n. 3, p. 221–224, 1 maio 2010.
CUNHA, E. M. DA; MARTINS, O. A. Principais compostos químicos presente nos venenos de cobras dos gêneros Bothrops e Crotalus—uma revisão. Revista Eletrônica de educação e ciência, v. 2, n. 2, , 2012. v. 2, n. 2, p. 21–26, 2012.
DANIELL, H. et al. Plant-made vaccine antigens and biopharmaceuticals. Trends in Plant Science, v. 14, n. 12, p. 669–679, 1 dez. 2009.
DARGAUD, Y. et al. Use of thrombin generation assay to personalize treatment of breakthrough bleeds in a patient with hemophilia and inhibitors receiving prophylaxis with emicizumab. Haematologica, v. 103, n. 4, p. e181–e183, 1 abr. 2018.
DEMAIN, A. L.; VAISHNAV, P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances, v. 27, n. 3, p. 297–306, 1 maio 2009.
DI CERA, E. Serine Proteases. IUBMB life, v. 61, n. 5, p. 510–515, maio 2009.
DOLEY, R.; KINI, R. M. Protein complexes in snake venom. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 66, n. 17, p. 2851–2871, 1 set. 2009.
DOS SANTOS, I. G. C.; FORTES-DIAS, C. L.; DOS SANTOS, M. C. Aplicações farmacológicas dos venenos de serpentes brasileiras enfoque para Crotalus durissus terrificus e Crotalus durissus ruruima1. [s.d.].
FENKER, J. et al. Phylogenetic diversity, habitat loss and conservation in South American pitvipers (Crotalinae: Bothrops and Bothrocophias). Diversity and Distributions, v. 20, n. 10, p. 1108–1119, 2014.
FERREIRA, M. L. et al. Toxic activities of venoms from nine Bothrops species and their correlation with lethality and necrosis. Toxicon, v. 30, n. 12, p. 1603–1608, dez. 1992.
FISCHER, R. et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. p. 4, 1999.
GECCHELE, E. et al. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. JoVE (Journal of Visualized Experiments), n. 97, p. e52459, 23 mar. 2015.
GELVIN, S. B. Agrobacterium Biology: From Basic Science to Biotechnology. [s.l.] Springer, 2018.
GUO, M. et al. Agrobacterium-mediated horizontal gene transfer: Mechanism, biotechnological application, potential risk and forestalling strategy. Biotechnology Advances, v. 37, n. 1, p. 259–270, 1 jan. 2019.
GUTIÉRREZ, J. M.; ESCALANTE, T.; RUCAVADO, A. Experimental pathophysiology of systemic alterations induced by Bothrops asper snake venom. Toxicon, v. 54, n. 7, p. 976– 987, dez. 2009.
HAMILTON, S. R.; GERNGROSS, T. U. Glycosylation engineering in yeast: the advent of fully humanized yeast. Current Opinion in Biotechnology, Expression technologies / Tissue and cell engineering. v. 18, n. 5, p. 387–392, 1 out. 2007.
HEDSTROM, L. Serine Protease Mechanism and Specificity. Chemical Reviews, v. 102, n. 12, p. 4501–4524, dez. 2002.
Herpetologia Brasileira. v. 8, p. 64, 2018.
ISABEL, T. F. et al. Expression and partial biochemical characterization of a recombinant serine protease from Bothrops pauloensis snake venom. Toxicon, v. 115, p. 49–54, 1 jun. 2016.
JABLAOUI, A. et al. Biotechnological Applications of Serine Proteases: A Patent Review. Recent Patents on Biotechnology, v. 12, n. 4, p. 280–287, 2018.
KOMAROVA, T. V. et al. Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals. Expert Review of Vaccines, v. 9, n. 8, p. 859–876, 1 ago. 2010.
LEUZINGER, K. et al. Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins. Journal of Visualized Experiments : JoVE, n. 77, 23 jul. 2013.
M. RODRIGUES, V. et al. Bothrops pauloensis Snake Venom Toxins: The Search for
New Therapeutic Models. Text. Disponível em:
<https://www.ingentaconnect.com/content/ben/ctmc/2015/00000015/00000007/art00011>. Acesso em: 4 abr. 2019.
MA, J. K.-C.; DRAKE, P. M. W.; CHRISTOU, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics, v. 4, n. 10, p. 794–805, out. 2003.
MACHADO, A. S. et al. Acidente vascular cerebral hemorrágico associado à acidente ofídico por serpente do gênero bothrops: relato de caso. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 43, n. 5, p. 602–604, out. 2010.
MACHADO, T.; SILVA, V. X.; SILVA, M. J. DE J. Phylogenetic relationships within Bothrops neuwiedi group (Serpentes, Squamata): Geographically highly-structured lineages, evidence of introgressive hybridization and Neogene/Quaternary diversification. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 71, p. 1–14, fev. 2014.
PAGE, M. J.; DI CERA, E. Serine peptidases: Classification, structure and function. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 65, n. 7–8, p. 1220–1236, abr. 2008.
PEYRET, H.; LOMONOSSOFF, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology, v. 83, n. 1, p. 51–58, 1 set. 2013.
PINHO, F. M. O.; PEREIRA, I. D. Ofidismo. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 47, n. 1, p. 24–29, mar. 2001.
QUEIROZ, G. P. et al. Interspecific variation in venom composition and toxicity of Brazilian snakes from Bothrops genus. Toxicon, v. 52, n. 8, p. 842–851, dez. 2008.
RODRIGUES, R. S. et al. Combined snake venomics and venom gland transcriptomic analysis of Bothropoides pauloensis. Journal of Proteomics, v. 75, n. 9, p. 2707–2720, 17 maio 2012.
SAINSBURY, F.; THUENEMANN, E. C.; LOMONOSSOFF, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal, v. 7, n. 7, p. 682–693, 1 set. 2009.
SAJEVIC, T.; LEONARDI, A.; KRIŽAJ, I. Haemostatically active proteins in snake venoms. Toxicon, v. 57, n. 5, p. 627–645, 1 abr. 2011.
SERRANO, S. M. T. The long road of research on snake venom serine proteinases. Toxicon, Milestones and future prospects in snake venom research. v. 62, p. 19–26, 1 fev. 2013.
SOUCIE, J. M.; EVATT, B.; JACKSON, D. Occurrence of hemophilia in the United States. American Journal of Hematology, v. 59, n. 4, p. 288–294, 1998.
SRIVASTAVA, A. et al. Guidelines for the management of hemophilia. Haemophilia, v. 19, n. 1, p. e1–e47, 2013.
The Genome of Agrobacterium tumefaciens. Disponível em: <http://www.genomenewsnetwork.org/articles/12_01/A_tumefaciens_genome.shtml>. Acesso em: 1 set. 2020.
ULLAH, A. et al. Crystal structure of Jararacussin-I: The highly negatively charged catalytic interface contributes to macromolecular selectivity in snake venom thrombin-like enzymes. Protein Science, v. 22, n. 1, p. 128–132, 2013.
ULLAH, A. et al. Thrombin-like enzymes from snake venom: Structural characterization and mechanism of action. International Journal of Biological Macromolecules, v. 114, p. 788–811, 15 jul. 2018.
VARDAKOU, M. et al. Expression of active recombinant human gastric lipase in Nicotiana benthamiana using the CPMV-HT transient expression system. Protein Expression and Purification, v. 81, n. 1, p. 69–74, 1 jan. 2012.
WAHEED, H.; MOIN, S. F.; CHOUDHARY, M. I. Snake Venom: From Deadly Toxins to Life-saving Therapeutics. Current Medicinal Chemistry, v. 24, n. 17, p. 1874–1891, 2017.
WALSH, G. Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology. [s.l.] John Wiley & Sons, 2013.
YOUNG, C. L.; BRITTON, Z. T.; ROBINSON, A. S. Recombinant protein expression and purification: A comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal, v. 7, n. 5, p. 620–634, 1 maio 2012.