Atividades Biológicas

6.15.1 Atividade antibacteriana

A realização dos ensaios in vitro de atividade antimicrobiana foi baseada na norma M7-A6 (Vol. 23 Nº 2, CLSI, 2003) seguindo o método de microdiluição em caldo para determinação da concentração inibitória mínima, de acordo com Baron e colaboradores (1994).

Atividade antibacteriana da proteína recombinante em estudo foi avaliada contra

aeruginosa ATCC 9027. Para isso, amostra purificada, filtrada em filtro 0,22 µm (Milipore), da rCV2935, expressa em E. coli, na concentração de 1,1 mg/mL foi utilizada.

Inicialmente, cada microorganimo testado foi cultivado em caldo BHI (brain

heart infusion) e incubado a 35 °C por 4-6 h. Em seguida, um ajuste da densidade celular, também em caldo BHI, equivalente a escala McFarland 0,5 (1 x 108 UFC/mL) foi realizado. Após esse ajuste, foi realizada uma diluição de 100 vezes do inóculo, mais uma vez em meio BHI, para uma concentração final bacteriana de 1 x 106 _UFC/mL.

O ensaio foi realizado em placas de microtitulação (96 poços) de poliestireno, de fundo chato. Cada poço da placa continha o inóculo (100 µL), o meio de cultura líquido BHI (80 µL) e a solução de rCV2935, para concentrações finais que variaram de 110 a 0,5 µg/mL, considerando o volume final de 200 µL por poço. O controle positivo consistiu do antibiótico amicacina, nas concentrações de 120 a 0,5 µg/mL, e o controle negativo consistiu de água ultrapura estéril. Logo após a micropipetagem, as placas foram tampadas e incubadas a 35 ºC por 24 h, sem agitação, em ambiente escuro. Decorrido esse período, foi realizada a observação da placa a olho nu (verificação de turvação visível) e leitura da CIM (concentração inibitória mínima) em leitor de Elisa, nos comprimentos de onda de 492 e 690 nm.

6.15.2 Atividade antifúngica (levedura)

O ensaio com Candida albicans ATCC 10231 foi realizado de acordo com a metodologia descrita no item anterior, com duas modificações: o meio de cultura Sabouraud foi utilizado (ao invés de BHI) e o controle positivo consistiu do antifúngico Nistatina, em uma concentração inicial de 10 UI.

6.15.3 Atividade antifúngica (fungos filamentosos)

6.15.3.1 Cultivo dos fungos

Os fungos Colletotrichum lindemuthianum; Penicillium herquei e Rhizoctonia

solani foram cultivados em placas de Petri (100 x 15 mm), contendo 30 mL de meio Batata- Dextrose-Ágar (BDA) estéril. As culturas foram renovadas transferindo-se pellets de uma placa contendo o fungo (estoque) para outra contendo somente o meio de cultura. Todos os procedimentos foram realizados em câmara de fluxo laminar. As placas inoculadas foram

mantidas em câmara de germinação do tipo BOD a 27 ± 2 °C, umidade relativa de 70% e fotoperíodo de 12 horas (claro/escuro).

6.15.3.2 Obtenção da suspensão de conídios

As suspensões de conídios foram obtidas de acordo com a metodologia estabelecida por Melo e colaboradores (1997), com algumas modificações. Os conídios foram coletados a partir da adição de 10 mL de água destilada estéril sobre o micélio de cada fungo. Para a liberação de conídios, movimentos suaves na superfície do micélio foram realizados com auxílio de alça de Drigalski. Para a retirada de hifas, as suspensões obtidas foram filtradas em dois panos de nylon de malha fina estéreis. Os conídios foram contados com auxílio de uma câmara de Neubauer em microscópio óptico (Olimpus System Microscope BX 60). As suspensões foram ajustadas para uma concentração de 2 x 105 conídios/mL.

6.15.3.3 Ensaio de inibição da germinação de conídios em meio líquido

O ensaio de inibição da germinação dos conídios em meio líquido foi realizado segundo a metodologia descrita por Broekaert e colaboradores (1990), em placas de microtitulação de poliestireno, de fundo chato com 96 poços. Para montagem do ensaio, nos poços foram adicionados 10 µL da suspensão de conídios, equivalente a uma quantidade de 2 x 103 conídios, 100 µL da proteína recombinante rCV2935, expressa em E. coli, na concentração de 1 mg/mL, e meio YPD (100 µL). O controle negativo utilizado foi tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,2.

O crescimento fúngico foi monitorado pela leitura da absorbância a 630 nm, em intervalos de 4 h, durante 76 h, em leitor de ELISA (Biotrack II Plate Reader, Amersham Biosciences, USA). A avaliação do potencial antifúngico da proteína recombinante foi feita pela análise das curvas de crescimento dos fungos, quando comparadas àquelas dos controles.

6.15.4 Atividade inseticida

O efeito da quitinase recombinante rCV2935, expressa em E. coli, sobre o crescimento e desenvolvimento do caruncho C. maculatus (Fabricius, 1775), foi avaliado em bioensaios. Para tal, as proteínas secretadas pela E. coli para o meio de cultura, durante a indução da expressão de rCV2935, foram concentradas por precipitação com sulfato de amônio (para 95% de saturação) e a fração obtida (F0/95), contendo a proteína recombinante,

foi liofilizada e incorporada em sementes artificiais preparadas com cápsulas de gelatina, como descrito por Leite et al. (2005).

A fração F0/95 foi incorporada em farinha de feijão-caupi (Vigna unguiculata) nas concentrações de 0,5, 1,0, e 2,0% (p/p). O controle consistiu de sementes artificiais contendo apenas farinha de feijão-caupi. Os experimentos foram realizados em delineamento inteiramente casualizado com três (3) repetições para cada tratamento, com 10 sementes artificiais em cada repetição. As sementes artificiais foram acondicionadas em pequenos potes plásticos com tampa perfurada. Adultos (machos e fêmeas), com até 24 h de emergência de sementes de feijão-caupi, foram colocados em contato com as sementes artificiais para que houvesse a postura dos ovos sobre as mesmas. Os insetos permaneceram em contato com as sementes por uma semana para que todas elas apresentassem seis a oito ovos. Quando necessário, o excesso de ovos foi eliminado com auxílio de um estilete. Durante todo o experimento, os potes foram mantidos a uma temperatura média de 28 ± 1 °C, com fotoperíodo de 12 h e umidade relativa ambiente (cerca de 70%).

Após o final do período de oviposição, as sementes foram monitoradas diariamente até a emergência dos adultos. Nessa ocasião, o número de adultos emergidos de cada repetição e o dia em que emergiram, em relação ao início da oviposição, foi registrado. O peso de cada adulto emergido também foi determinado. Com esses dados, foram calculados o tempo médio de desenvolvimento e a percentagem de emergência de adultos.

Todos os resultados obtidos foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, usando 5% de significância. As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa GENES, desenvolvido pelo Prof. Cosme Damião Cruz, da Universidade Federal de Viçosa.