Aumentando a concentração das proteínas usando colunas Amicon

parece ser tanto a baixa concentração das proteínas TATκ-fatores em meio de cultura como a baixa quantidade de nutrientes e alta de metabólitos (lactato e amônio) devido ao consumo do meio de cultura (conforme pode se observar pela alteração da

cor do meio; Figura 36), decidiu-se concentrar o material utilizando colunas Amicon (Millipore, para proteínas de até 10 KDa). Centrifugando o meio de cultura nessas colunas é possível aumentar a concentração de proteínas em até 100 vezes em relação à concentração inicial. Uma vez concentrado, o material pode ser armazenado em freezer -80°C ou utilizado de imediato nas células. Para aumentar a eficiência, planejaram-se experimentos onde as células receberam o tratamento das primeiras horas logo em suspensão, de forma a maximizar a superfície de contato, incubados a 37°C. De forma a verificar se esse método é eficaz o suficiente, procurou-se promover um experimento de concentração das proteínas TATκ-GFP produzidas pelas células 293t-TATκ-GFP e na sequencia células MEF foram tratadas por diferentes intervalos de tempo com elas e avaliadas no dia seguinte por citometria de fluxo. (Figura 40).

Figura 40: TATκ-GFP concentrada é capaz de entrar nas células e ser detectável por citometria de fluxo.

Células MEF na segunda passagem foram tratadas com em suspensão 1µM de TATκ-GFP durante os tempos indicados e de forma a se verificar uma possível relação tempo-dependente na porcentagem de células marcadas. Density plots de (A) controle negativo, e células MEF tratadas após (B) 30 minutos, (C) 1 hora (D) duas horas, (E) três horas. (F) Histograma da célula no canal FL1, após o tratamento em suspensão por 3 horas demonstra uma diferença significativa entre as populações tratadas e controle negativo. (G) Representação gráfica da porcentagem de células fluorescentes em função do tempo. (N = 2)

Pode-se notar que a absorção de proteína apresenta uma relação tempo dependente na porcentagem de células que podem ser verdadeiramente consideradas GFP+. Além disso, diferentemente do que foi observado com a proteína rTAT-GFP (Figura 24) não há morte celular significativa, mesmo com tempo maior de tratamento (até 12h; dados não mostrados), indicando que não existem moléculas maiores do que 10kDa promovam a morte celular, como observado ao utilizar o

sistema transwell. Após estes encorajadores resultados, foi conduzida uma grande série de sete experimentos independentes promovendo-se o tratamento das células com meio condicionado concentrado produzido por linhagens produtoras (plaqueadas na densidade de 10x104 células/cm2, por 24 ou 48h; Figura 41). Nesses experimentos, na condição de 3% de O2, procurou-se também variar a proporção entre os fatores (triplicando-se a quantidade de OCT em relação aos demais) bem como o tipo de célula receptora e sua passagem, o tempo em suspensão, a presença ou não de ácido valpróico e o número de vezes que a troca de meio foi feita. Um sumário dessas combinações é apresentado na figura 41B. Além disso, os cálculos para estabelecer a referência da quantidade de proteína foram realizados a partir de das concentrações estimadas de ELISA ou por quantidade total de proteína por Bradford. Algumas placas foram acompanhadas com trocas diárias de meio por até 72 dias.

Figura 41: Tentativas com meio de cultura concentrado para reprogramar células ao estado pluripotente.

Concentrada TAT-k-fatores foram utilizados para tratar em suspensão MEF, fibroblastos de pele humanos ou hASC durante os tempos indicados. (A) esquema de tratamento proposto. (B) Resumo das tentativas para reprogramar usando essa abordagem (C) imagem representativa da colônia que emergiu após 20 dias do início do tratamento que apresentou a morfologia mais próxima da esperada para uma mIPS (Aumento de 200x).

Dessa vez, colônias com morfologia bastante semelhantes às células miPS apareceram nas placas, particularmente quando se utilizou uma mistura de 50:50 de meio condicionado concentrada médio e fresco, após trocas diárias por do meio com proteínas 14 dias e o acompanhamento da placa por 30 dias (Figura 41C). O ensaio de coloração de fosfatase alcalina e RT-PCR para marcadores de pluripotência

A)

B)

mostraram que estas colônias são falso-positivo. Outras tentativas foram feitas e não foi possível alcançar resultados favoráveis, sugerindo que pode haver ainda outros fatores complicadores. Outra possibilidade seria que alguma das proteínas estivesse com problemas, mas não necessariamente todas.

Em um esforço para melhor compreender e controlar o processo de reprogramação celular, uma nova série de experimentos foi planejada com MEFs. A partir desse momento as células humanas não foram mais utilizadas, dada a sua maior complexidade na reprogramação. Nesse experimento, antes de iniciar o tratamento com os quatro fatores de transcrição, foi realizada a infecção com retrovírus na tentativa de observar o efeito de cada TATκ-proteína independentemente. Ou seja, as células foram infectadas por pelo menos três retrovírus (por exemplo, OCT, KLF e MYC) e o fator de transcrição em falta (neste caso, SOX) foi complementado com o meio de cultura condicionado e concentrado. Como controle positivo foi realizada uma placa com os quatro retrovírus (OSKM) mais eGFP e como controle negativo foi utilizada células infectadas com retrovírus eGFP apenas (importante para estimar a eficiência de infecção; (Figura 42).

Sete experimentos foram realizados. Em quatro deles foi observada uma alta taxa de infecção (superior a 80%) e houve formação de colônias depois de 20 dias. Em todas as combinações, exceto quando TATκ-OCT foi complementado, 2-3 colônias surgiram por poço. No entanto, novamente, eles não eram miPS verdadeiras. Diferentemente do controle positivo e do poço onde foram utilizados os vírus OSK complementado com TATκ-MYC, elas não eram positivas para fosfatase alcalina e também não proliferaram depois de repicadas (Figura 42C). Para melhor avaliar a complementação com TATκ-MYC seria necessário ter incluído o controle de apenas

os 3 vírus OSK e comparado em termos de eficiência de reprogramação e de tamanho das colônias se a complementação do TATκ-MYC foi efetiva.

Figura 42: Verificação do funcionamento das TATκ-proteínas independentemente.

(A) Representação esquemática do esquema de tratamento da última abordagem para a obtenção das células TATκ-iPS. (B) imagem representativa de uma colônia que surgiu e é fosfatase alcalina negativa após 20 dias do início do novo tratamento. (C) Imagens representativas de colônias verdadeiras que surgiram no controle positivo (Aumento de 100x). Infecção retrovirus – Placa de 6 poços Plaqueamento no feeder – Placas de 12 poços Repetir 4x Intervalos de 72h Células aderidas Replaqueamento das colônias no feeder após 20 dias +VPA 3% O2 Tratamento com proteínas concentradas Tripsinização 24h 1-2 dias A) B) C)