Avaliação da capacidade de geração de ASCs mediante co-cultura de linfócitos B humanos e monócitos infectados com DEN

Tendo em vista que nosso objetivo é compreender a expansão massiva de ASCs vista durante a infecção pelo DENV, e que, devido à baixa incidência de Dengue na cidade de São Paulo/SP nos anos que sucederam o início desse projeto a obtenção de amostras de pacientes foi imensamente prejudicada. Dessa forma, decidimos testar um modelo in vitro de diferenciação em ASCs proposto por Kwissa et al. (2014), onde células B isoladas foram colocadas em co-cultura com monócitos previamente infectados com DENV por 48 horas.

Em parceria com o Professor Luis Carlos de Souza Ferreira do Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas no Departamento de Microbiologia do ICB/USP, iniciamos as primeiras tentativas de execução deste protocolo. Para tais, utilizamos um vírus da Dengue, isolado clínico da Nova Guiné C (DENV2 NGC), pertencente ao sorotipo 2. Inicialmente, tivemos dificuldades na recuperação dos monócitos infectados da placa de cultura e algumas modificações do protocolo foram necessárias

53 (dados não gerados). Acertado isso, conseguimos levar o experimento a diante. Entretanto, a capacidade de geração de ASCs através desse modelo foi ínfima, como demonstrado pelos dados de ELISPOT (Figura 17 A representativo e Figura 17 B ASCs por milhão). Quando mantidas em co-cultura com monócitos não infectados, 10 ASCs por milhão de célula B foram enumeradas (Figura 17 B). Apenas 36 ASCs por milhão de células B foram geradas quando colocadas em co-cultura com monócitos previamente infectados durante 48 horas com o DENV2 NGC (Figura 17 B). Estes números eram muito aquém daqueles obtidos quando células B foram tratadas com mitógenos (Figura 22).

A)

B)

Células secretoras de IgG

0 10 20 30 40 Cél B Cél B + monócitos Cél B + monócitos infec. Limite de  deteção A S C p o r m il h ã o d e c é lu la s NS

Figura 17 – Avaliação da capacidade de geração de ASCs mediante co-cultura de linfócitos B e monócitos humanos infectados com DENV2 NGC. Linfócitos B humanos foram isolados de PBMCs através de beads magnéticas anti-CD19 e mantidos em cultura por 6 dias isoladamente ou na presença de monócitos isolados de PBMCs através de beads magnéticasaAnti-CD14+, infectados ou não pelo vírus da Dengue sorotipo 2, isolado clínico da Nova Guiné C (DENV2 NGC), MOI:1, por 48 horas. A) Comparação entre o número de “spots” gerados em cada uma das

54 condições, sem diluição (2x105 _{células viáveis/poço). B) Número absoluto de ASCs}

produtoras de IgG por milhão de células. Dados representativos de um único experimento.

Decidimos então, avaliar este mesmo modelo utilizando outra cepa de DENV, conhecida por uma maior adaptação na capacidade infectiva in vitro: a DENV4 TVP/360 (vírus da Dengue sorotipo 4 TVP/360). Esta etapa foi realizada em parceria com o Laboratório de Virologia Molecular do Instituto Carlos Chagas – Fiocruz/PR (Curitiba – PR), sob a supervisão da Pesquisadora Claudia Nunes Duarte dos Santos e orientação da Pesquisadora Pryscilla Wowk. Desta vez, testamos o MOI:10 além do MOI:1 descrito no protocolo original por Kwissa et al. (2014) (Figura 18).

Figura 18 – Avaliação da capacidade de geração de ASCs mediante co-cultura de linfócitos B e monócitos humanos infectados com DENV4 TVP/360 em diferentes multiplicidades de infecção (MOIs). Imagem representativa do número de “spots” gerados (2x105 _{células viáveis/poço) a partir de linfócitos B humanos}

isolados de PBMCs com beads magnéticas anti-CD19 e mantidos em cultura por 6 dias isoladamente ou na presença de monócitos isolados de PBMCs através de beads magnéticas anti-CD14+, infectados ou não pelo vírus da Dengue sorotipo 4 cepa TVP/360 (DENV4 TVP/360). Foram utilizados os MOI:1 e MOI:10, e o contato vírus- monócito foi mantido por 48 horas. Dados representativos de um único experimento.

Diferentemente do esperado, nenhum spot foi detectado, independente do MOI utilizado e de termos utilizado uma cepa de DENV adaptada para infecções in vitro (Figura 18).

Em seu trabalho, Kwissa et al. (2014) destacaram a importância dos monócitos portadores do fenótipo duplo positivo CD14+ CD16+ para a promoção da diferenciação de células B em ASCs na resposta contra o DENV. Sendo assim, nos questionamos se a falta de diferenciação encontrada em nossos ensaios estava relacionada com a não aquisição do fenótipo duplo positivo pelos monócitos na

55 presença do DENV4 TVP/360. Para responder à essa pergunta, realizamos uma análise cinética da expressão dos marcadores CD14 e CD16 nessas células nos tempos 0, 24, 48 e 72 horas (Figura 19 A imagem representativa e B porcentagem no grupo amostral). A) B) % de monócitos CD14+ CD16+ 0 20 40 60 80 100 Mock DENV4 TVP/360 Mock DENV4 TVP/360 Mock DENV4 TVP/360 Mock DENV4 TVP/360

0 horas 24 horas 48 horas 72 horas

% d e c é lu la s C D 1 4 + C D 1 4 +

Figura 19 – Avaliação da capacidade de aquisição do fenótipo duplo positivo (CD14/CD16) por monócitos mantidos em cultura durante 72h com ou sem a presença de DENV. Monócitos (CD14+) foram isolados por beads magnéticas a partir de PBMCs de indivíduos saudáveis. Estes, foram infectados ou não pelo vírus da Dengue cepa TVP/360 pertencente ao sorotipo 4 (DENV4 TVP/360). Foi utilizado um MOI:1 e o contato vírus-monócito foi mantido por 72 horas em cultura. Após esse período, essas células foram recuperadas, lavadas e marcadas com anticorpos anti- CD16 e anti-CD14 conjugados a fluorocromos. As leituras correspondentes às

56 fluorescências foram adquiridas em um citômetro de fluxo e as análises realizadas através do software FlowJo. A) Imagem representativa. B) Porcentagem de células duplo positivas para CD14 e CD16. Dados apresentados como mediana (linha) e valores individuais (n=3; círculos), estatisticamente comparados de forma pareada por teste Friedman e pós teste Dunn’s.

Foi possível observar que a simples manutenção desses monócitos em cultura, independente da presença do vírus, já fazia com que eles adquirissem o fenótipo duplo positivo (CD14+ CD146+) (Figura 19 A imagem representativa e B porcentagem no grupo amostral). Portanto, a hipótese anterior foi descartada.

Já o protocolo de infecção por DENV padronizado para PBMCs no Laboratório de Virologia Molecular do Instituto Carlos Chagas – Fiocruz/PR (Curitiba – PR) consistia em manter as células em contato com o inóculo viral por 1 hora, na presença de meio RPMI não suplementado com soro fetal bovino, seguido da remoção do inóculo e lavagem das células. Suspeitando que a manutenção dos monócitos em contato com o vírus por 48 horas, conforme preconizado no protocolo de Kwissa et al. (2014), estivesse potencialmente induzindo a morte dos mesmos, ou ainda, que durante esse período as células B mantidas em “resting” estivessem igualmente perdendo o seu potencial de ativação, decidimos testar uma última adaptação neste modelo. Dessa vez, infectamos os monócitos seguindo a padronização do Laboratório de Virologia Molecular do Instituto Carlos Chagas – Fiocruz/PR (Curitiba – PR), removendo o inóculo viral após 1 hora e só então, esses monócitos foram colocados em contato com as células B (Figura 20).

Figura 20 – Avaliação da capacidade de geração de ASCs mediante co-cultura de linfócitos B e monócitos humanos infectados por somente 1 hora com DENV4 TVP/360. Imagem representativa do número de “spots” gerados (1,1x104 _células

viáveis/poço) a partir de linfócitos B isolados de PBMCs com beads magnéticas anti- CD19 e mantidos em cultura por 6 dias isoladamente ou na presença de monócitos

57 isolados de PBMCs com beads magnéticas Anti-CD14+, infectados ou não pelo vírus da Dengue sorotipo 4 cepa TVP/360 (DENV4 TVP/360). Foi utilizado um MOI:1 e o contato vírus-monócito foi mantido por 1 hora, seguido de remoção do inóculo viral e lavagem das células. Dados representativos de um único experimento contendo 4 diferentes amostras.

Como é possível observar, mesmo com a modificação do protocolo de infeção, não foram detectados “spots” mediante co-cultura de linfócitos B (CD19+) e monócitos (CD14+) (Figura 20).

Desta forma, por não conseguirmos reproduzir a diferenciação de células B em ASCs descrita por Kwissa et al. (2014), decidimos abandonar o modelo e buscar novas estratégias.

5.5. Avaliação da capacidade de geração de ASCs mediante estimulação de