As colunas de acesso restrito podem ser classificadas e diferenciadas quanto ao material ligado/adsorvido a superfície externa do suporte sólido responsável pela exclusão de macromoléculas. Entre estes materiais estão as proteínas imobilizadas BSA e 1-ácido glicoproteínas (AGP).
Hermansson e Grahn153 desenvolveram, em 1994, uma coluna com a AGP ligada covalente em sua superfície, com grupamentos C8 e C18 no interior de
seus poros (Biotrap, Chromatech). Os poros usados foram pequenos suficientes para que não houvesse a permeabilidade de proteínas e macromoléculas.
Hermansson e colaboradores154 também utilizaram tais colunas em um sistema multidimensional, no modo backflushing, para a determinação de atenolol, propanolol e ibuprofeno em plasma. O uso de pareador iônico foi estudado como fator responsável pelo aumento nos valores de recuperação já que tais compostos possuem uma natureza hidrofílica e facilidade de se ligar a proteínas.
A comparação entre as colunas de extração Biotrap e LiChrospher ADS RP18 foi feita por El Mahjoub e Staub155 na determinação de flunitrazepam e seus metabólitos em plasma. A diferença entre as duas colunas de extração testadas é explicada pela diferença de composição de sua superfície externa. A
y = 258831x + 188765 r = 0,9997
y = 104104x + 146782 r = 0,9990
coluna LiChrospher possui em sua superfície externa grupamentos dióis, enquanto a Biotrap possui a proteína AGP ligada covalente em sua superfície. A coluna Biotrap apresentou um maior tempo de vida e capacidade de suportar mais de 1500 injeções de 50 L de plasma se comparado com as colunas LiChrospher (800 injeções de 50 L de plasma), além de capacidade de utilização em uma faixa de pH mais ampla.
A avaliação e caracterização das colunas BioTrap 500 C18 em
condições como fase móvel, estabilidade e o máximo da quantidade de matriz injetada também foi avaliada por Yu e colaboradores156.
Breindahl et al 157 utilizaram as colunas Biotrap na primeira dimensão de um sistema LC-MS/MS para a determinação de ropivacaina em plasma e Friedrich et al158 para determinação dos metabólitos da testosterona em hepatócitos.
Dessa forma, neste trabalho, realizou-se um estudo que visa a obtenção de uma nova coluna de meio de acesso restrito de proteína: - lactoglobulina. O modo de preparo feito foi similar ao utilizado para as colunas RAM-BSA.
Como maior constituinte presente no soro do leite bovino, a - lactoglobulina (LG) é uma proteína globular de aproximadamente 18,4 kDa e contém 162 resíduos de aminoácidos, seu pI está em torno de 5,2159.
Uma comparação entre a quantidade relativa das principais proteínas do soro bovino no leite bovino e humano é mostrada da tabela 4.4.
Sua conformação espacial, uma espécie de cálice ou barril achatado capaz de ligar pequenas moléculas hidrofóbicas no seu interior, foi completamente elucidada por Brownlow et al.160.
Essa conformação contribui para a estabilidade da LG em solução em uma ampla faixa de pH, porém, apresenta diferentes estados de associação. Em valores de pH acima do pI possui conformação na forma de dímeros.
Tabela 4.4: Quantidade relativa das principais proteínas do soro do leite
Proteínas do soro (g/L) Leite Bovino Leite Humano
– lactoglobulina 3,2 Desprezível
– lactoglobulina 1,2 2,8
Albumina sérica bovina (BSA) 0,4 0,6
Imunoglobulinas 0,7 1,0
Lactoferrina 0,1 0,2
Lisozima Desprezível 0,4
A BSA, outra proteína presente no soro do leite bovino, tem conformação globular nativa, solúvel em água, tem massa molecular de 66,2 kDa, 580 resíduos de aminoácidos e pI 4,7. A albumina do soro bovino presente no leite é idêntica àquela isolada do soro sanguíneo 161.
Como citado anteriormente, a utilização da proteína BSA no preparo de colunas de meio de acesso restrito de proteínas imobilizadas é um método bem estabelecido, de fácil realização e que mostra resultados bastante satisfatórios como técnica de preparo de amostras on-line.
O sucesso do procedimento de imobilização está diretamente relacionado a presença dos resíduos de lisina na superfície das proteínas em estudo, já que estes reagem com o glutaraldeído e promovem o entercruzamento entre as proteínas, o que confere maior estabilidade e durabilidade da coluna, evitando assim a perda de proteínas que poderia acontecer se estas estivessem apenas adsorvidas no suporte cromatográfico (Figura 4.20).
A BSA possui uma quantidade três vezes maior de resíduos de lisina em sua superfície se comparada com a LG. A Figura 4.21 apresenta a estrutura das duas proteínas e destacado, na cor rosa, os resíduos de lisina presentes na superfície.
Figura 4.19: Seqüência de reações para o entercruzamento da BSA e redução das bases de Schiff e aldeídos residuais.
Figura 4.20: Representação estrutural da LG e BSA, em destaque os resíduos de lisina na superfície das proteínas
B S A - L a ct o gl o b
As condições cromatográficas para a retenção dos antibióticos em estudo foram avaliadas nesta nova coluna. Para tal, foram testadas as condições anteriormente utilizadas em colunas RAM-BSA C8.
As condições desenvolvidas para o método cromatográfico multidimensional, com a coluna RAM-LG na primeira dimensão, estão descritas na Tabela 4.5.
Tabela 4.5: Condições utilizadas no acoplamento das colunas RAM-LG C8 (50 ×
4,6 mm Luna-Phenomenex®, 10 µm e 100 Å) e analítica C18 (150 × 4,6 mm Luna-
Phenomenex®, 10 µm e 100 Å), para análise de amoxicilina e ampicilina em leite bovino.
Tempo
(min) Bomba Evento
Posição da válvula
0 – 2 Linha A
(Bomba 1) Exclusão das proteínas do leite 1
2 – 6 Linha B (Bomba 1)
Eluição dos fármacos amoxicilina e
ampicilina 1
4 – 6 Linha B (Bomba 1)
Transferência da amoxicilina e ampicilina
para a coluna analitica 2
6 – 11 Linha A (Bomba 2)
Análise da amoxicilina e ampicilina pela
coluna analítica 1
6 – 11 Linha C
(Bomba 1) Limpeza da coluna RAM 1
11-16 Linha A
(Bomba 1) Condicionamento da coluna RAM 1
Condições cromatográficas: Bomba 1: (A) tampão formiato de amônia 10 mmol/L pH 6,0; (B) tampão formiato de amônia 10 mmol/L pH 6,0 : MeOH (70:30 v/v); (C) ACN:H2O:isopropanol
(75:15:10 v/v/v) e Bomba 2: (A) tampão formiato de amônia 10 mmol/L pH 6,0: MeOH (70:30 v/v). Volume de injeção: 200 L; vazão: 1mL/min em ambas as colunas; : 230 nm e T= 30
A injeção direta de leite fortificado com amoxicilina e ampicilina nas condições descritas na Tabela 7.5 forneceu o cromatograma da Figura 4.22.
Figura 4.21: Cromatograma da análise de leite fortificado com amoxicilina e ampicilina (20 g/mL), com acoplamento das colunas RAM-LG C8 (50 × 4,6mm
Luna-Phenomenex®, 10 µm e 100 Å) e analítica C18 (150 × 4,6 mm Luna-
Phenomenex®, 10 µm e 100 Å). Condições cromatográficas descritas na tabela 7.5.
Porém, as colunas de LG não conseguiram manter sua eficiência na análise dos fármacos em estudo. Com o passar do tempo, a coluna perdeu sua capacidade de retenção e resolução. Na Figura 4.23 é apresentada a comparação entre cromatogramas referentes a injeção do padrão contendo amoxicilina e ampicilina em água na coluna RAM LG C8 em diferentes tempos: o primeiro
cromatograma refere-se a uma injeção na coluna recém preparada; o segundo cromatograma refere-se a 60 dias e o terceiro cromatograma a 75 dias após o preparo.
Figura 4.22: Cromatogramas referentes a injeção de padrão de amoxicilina e ampicilina em água na coluna RAM-LG C8 (50 × 4,6 mm Luna-Phenomenex®, 10
µm e 100 Å). (A) 30 dias (B) 60 dias e (C) 75 dias após o preparo da coluna.
Tal alteração no perfil cromatográfico pode ser atribuída a uma mudança na conformação da proteína imobilizada. A possível eluição da proteína foi descartada como causa da perda da resolução cromatográfica ao injetar água na coluna e monitorar o comprimento de onda referente ao máximo de absorção das proteínas, 280 nm, obtendo-se apenas a linha de base. O que sugere que a LG foi eficientemente imobilizada no suporte cromatográfico.
Dessa forma, novas formas de imobilização devem ser estudadas de forma a garantir a estabilidade e integridade da LG no suporte cromatográfico.