AVALIAÇÃO COMPLEMENTAR DA SELETIVIDADE

Foi realizado um experimento para investigação de potenciais eventos interferentes. Primeiramente, seis diferentes eventos de milho foram analisados para pesquisa do gene RR® utilizando a Nested PCR, sendo estes: Bt11 a 5 %, MON 810 a 5 %, GA21 a 5 %, NK603 a 5 %, TC1507 a 10 % e Bt176 a 2 % (as concentrações

diferiram devido às concentrações dos MRC disponíveis). Os fragmentos da construção gênicas dos milhos GM estão listados na Figura 13.

Bt11

CaMV 35S cry1A(b) T-NOS CaMV 35S pat T-NOS

MON810

CaMV 35S hsp70 cry1A(b)

GA21

r-actin1 OTP mEPSPS T-NOS

NK603

r-actin1 CTP2 CP4 EPSPS T-NOS CaMV 35S CTP2 CP4 EPSPS T-NOS r-actin1

TC1507

Cry1F Região

homóloga

ubIZM Cry1F ORF25 CaMV 35S pat T35S ORF25 Região

homóloga pat

Bt176

P-PEPC cry1A(b) PECP9 T35S

Figura 13. Representações esquemáticas das construções genéticas presentes nos eventos de milho geneticamente modificados Bt11, MON810, GA21, NK603, TC1507 e Bt176.

Adaptado de YANG et al. (2007), DINON (2011) e GMDD (2013).

Os elementos em comum à soja RR® são: promotor e terminador para o milho Bt11, promotor para o milho MON810, terminador para o milho GA21, sequência CP4EPSPS e terminador para o milho NK603, promotor para o milho Tc1507 e promotor para o milho Bt176.

Para uma investigação mais aprofundada foram selecionados os milhos Bt11 e GA21. O efeito dos interferentes selecionados sobre a seletividade do método foi investigado por meio da análise de amostras formuladas de forma a se obter os interferentes, na presença e na ausência do evento alvo, conforme representado na Figura 14. A concentração de soja RR _{selecionada correspondeu a 0,030 %,}

menor nível com 100 % de TCF na etapa anterior da validação. A concentração dos interferentes foi relevante para ocasionar alteração na identificação do analito, ou seja, 2,0 %, que foi definido em função da concentração dos MRC disponíveis e de suas quantidades. Os extratos de DNA das amostras foram quantificados pela técnicas de eletroforese e fluorimétrica e, a partir desta etapa, foram realizadas duas Nested PCR, uma para cada replicata de amostra, totalizando 80 ensaios.

Figura 14. Representação esquemática do delineamento experimental proposto para avaliação complementar da seletividade (na presença de interferentes).

As amostras foram preparadas da seguinte forma: alíquotas de 80 mg de milho Bt11 (5 %) e 6 mg de soja RR® _{(1,0 %) foram adicionados de 114 mg de soja}

100 % convencional, correspondendo a amostras contendo 0,030 % de soja RR® _na

presença de 2,0 % de milho Bt11. Nas amostras brancas, alíquotas de 80 mg de milho Bt11 (5 %) foram adicionadas de 120 mg de soja 100 % convencional, correspondendo a amostras contendo 2,0 % de milho Bt11. O mesmo procedimento foi adotado para o milho GA21 (Tabela 13).

Tabela 13. Concentrações das amostras formuladas e respectivas massas do material de referência certificado de milho geneticamente modificado, material de referência de soja Roundup Ready _{e de soja 100 % convencional}

Formulações Concentração de milho GM na amostra (%) Concentração de soja RR® _na amostra (%) Massa do MRC de milho GM 5 % (mg) Massa de soja 100 % convencional (mg) Massa do MRC de soja RR® 1 % (mg) Milho Bt11 + Soja convencional 2,0 - 80 120 - Milho Bt11 + Soja RR® + Soja convencional 2,0 0,03 80 114 6 Milho GA21 + Soja convencional 2,0 - 80 120 - Milho GA21 + Soja RR® + Soja convencional 2,0 0,03 80 114 6

GM: geneticamente modificado; MRC: material de referência certificado; RR®: Roundup Ready®

As amostras foram preparadas e analisadas aleatoriamente, em uma única bateria analítica, sendo 10 replicatas por nível. As amostras foram cegas para o analista.

Na análise de dados, foi feita a avaliação da alteração na TCF do método devido à presença do interferente, ou seja, na alteração das taxas de falsos resultados, adotando-se como critério uma TCF mínima de 95 %.

4.7.4 AVALIAÇÃO DA ROBUSTEZ

O delineamento experimental para o estudo da robustez foi o experimento fatorial completo. Neste caso, foram realizados ensaios com amostras formuladas na concentração de soja RR

de 0,030 %, menor nível com 100 % de TCF na etapa anterior da validação, sob diferentes condições experimentais, sendo um mínimo de 10 replicatas verdadeiras por condição. O esquema de um delineamento

experimental fatorial completo para dois fatores e três níveis está representado na Figura 15, totalizando 120 ensaios nestas etapa da validação.

Figura 15. Representação esquemática de delineamento experimental fatorial 2x3 para avaliação da robustez, em um nível de concentração com 100% de confiabilidade.

Um dos fatores escolhidos para avaliar a robustez foi a marca da Taq DNA Polimerase. A Taq DNA polimerase é a catalisadora da extensão dos iniciadores. Ela é uma molécula termoestável e para muitos ensaios a quantidade ótima está entre 0,5 e 2,5 unidades. O aumento da concentração pode resultar na redução da seletividade (CURY, FURUSE & ARAÚJO, 2005). Assim, foram escolhidas duas marcas de Taq DNA Polimerase: A e B.

O outro fator escolhido foi a concentração de DNA alvo. A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deve ser otimizada. Para uma PCR ótima é necessária uma baixa concentração de DNA. O excesso de molde

pode favorecer o anelamento das duas fitas do molde, mais do que seu anelamento com o par de iniciadores e irá também aumentar a chance de formação de produtos não-específicos. Entretanto, com pouca quantidade de molde, as sequências complementares poderão não se encontrar com os iniciadores (CURY, FURUSE & ARAÚJO, 2005). Assim, foram escolhidas três concentrações de DNA alvo: 25, 50 e 75 ng/µL.

As amostras foram preparadas e analisadas aleatoriamente, em uma única bateria analítica, sendo 10 replicatas por condição. As amostras foram cegas para o analista.

No caso de métodos sensoriais, como kits ou os de simples observação visual, o efeito dos fatores estudados é avaliado pela alteração na TCF. Na avaliação da robustez do método, considerou-se efeito significativo dos fatores estudados sobre o desempenho do método nos casos em que a TCF foi menor que 95 %.