Ensaio de citotoxicidade
A avaliação da citotoxicidade foi realizada pelo método colorimétrico do MTT
ou brometo [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil] tetrazólio 29, 30. As células de
monócito/macrófago RAW 264.7 foram plaqueadas numa concentração de 1 x 106
células /poço em placas de 96 poços e mantida em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen Inc) suplementado com 100 U/mL penicilina, 100 µg/mL estreptomicina e 10% de soro bovino inativado e foram colocadas para aderir por duas horas. Após este período, os compostos foram adicionados nas concentrações desejadas diluídas em DMEM. As placas foram incubadas em estufa de CO2 a 37º durante 24
horas. Após 24 horas o sobrenadante foi descartado. Cada poço recebeu 200µL de MTT (0,5mg/mL) e as placas foram reincubadas durante 3 horas, em estufa a 37°C e 5%
CO2. Após esse período, o sobrenadante foi desprezado, e o precipitado foi
ressuspendido em 150µL de DMSO para a dissolução do cristal de formazan. Para a quantificação do sal reduzido nas células vivas, as absorbâncias foram lidas com o auxílio do espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 450nm. Foram testadas 3 doses dos compostos testes: 50, 25 e 12,5µ/mL. Os resultados mostraram que os produtos não causaram citotoxicidade significada na dose de 50mg/mL, sendo
15 escolhida para o ensaio a dose de 50 µ/mL por apresentar cerca de 95-100% de células viáveis.
Ensaio para avaliação da atividade anti-inflamatória in vitro
Para triagem dos produtos foi feito o teste anti-inflamatório in vitro utilizando a linhagem de célula de monócito/macrófago RAW 264.7 que foi mantida em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen Inc) suplementado com 100U/mL penicilina, 100µg/mL estreptomicina e 10% de soro bovino inativado. A linhagem foi fornecida pelo Banco de Células do Rio de Janeiro. A metodologia foi feita de acordo com Huang et al., 2008 com pequenas modificações. As células foram deixadas em incubação a 37 ºC com 5% CO2. Após atingirem a confluência de 90% as células serão raspadas com scraper para a contagem. As células foram semeadas em placas de 96 poços numa densidade de 0,4 x 106 células/poço (a contagem de células viáveis foi feita através da coloração com azul tripano usando um hemocitômetro) 24 horas antes dos tratamentos. Após este período, as células foram lavadas com PBS e tratadas com os compostos testes em doses pré-determinadas por duas horas antes da estimulação com LPS na concentração de 1µg/mL por um período adicional de 24 horas. Para cada experimento foram utilizados um controle positivo (células tratadas apenas com LPS) e um controle negativo (células sem nenhum tratamento). Duas replicatas foram feitas para os tratamentos e controles. Ao final do tratamento, o sobrenadante de todos os poços foi coletado e armazenado em freezer a -80º C para posterior determinação das citocinas 31, 32.
16
Determinação por ELISA de citocinas no sobrenadante da cultura de células RAW
264.7
As dosagens de IL-1β, TNF-α no sobrenadante da cultura de células foram realizadas pela técnica de ELISA sandwich de captura, empregando anticorpos monoclonais, específicos para detecção de citocinas. Placas de ELISA (2595, Costar, Cambridge, MA, USA) sensibilizadas com anticorpo de captura diluído em PBS foram incubadas à temperatura ambiente e bloqueadas com uma solução de PBST (Tampão salina fosfato mais 0.05% de Tween 20) e SBF (WL. Imunoquímica, Rio de Janeiro/Brasil). Após bloqueio, as placas foram lavadas com PBST e, em seguida, adicionados os respectivos padrões recombinantes ou amostras em duplicata nas diluições adequadas. Os padrões e as amostras foram diluídos em meio RPMI 1640 (Cultilab, São Paulo/Brasil) mais 2% de SBF. As placas foram incubadas a 4°C. Após esta incubação, as placas foram lavadas com PBST e o segundo anticorpo biotinilado diluído com PBST mais 0.1% de soro albumina bovina (BSA) (SIGMA Chemical, St. Louis, Mo., USA) foi adicionado, seguido de incubação à temperatura ambiente. Após esta incubação, cada placa foi novamente lavada com PBST e o conjugado enzimático 1:3000 (estreptoavidina marcada com peroxidase, Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA) diluído em PBST contendo BSA 0.1% foi adicionado às placas e incubadas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas novamente com PBST e a reação revelada pela adição do substrato contendo H2O2 e o cromógeno ABTS (2,2’-azinobis
(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA) dissolvidos em tampão citrato fosfato de sódio. A reação foi bloqueada com ácido
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Agradecimentos
Gostaria de agradecer ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), INCT_if (Instituto Nacional em Ciência e Tecnologia para Inovação Farmacêutica) e a CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), pelos incentivos a este trabalho.
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