Avaliação da atividade antinociceptiva em modelo de nocicepção incisional (Nocicepção

pós- operatória)

Este teste teve como objetivo avaliar a capacidade da toxina Tx3-4 de reverter um quadro nociceptivo previamente instalado em modelo de nocicepção clinicamente relevante. Inicialmente, verificamos que a incisão na pata de camundongos induz uma intensa alodínia mecânica, caracterizada como uma redução no limiar de detecção do estímulo mecânico em relação aos valores basais (Fig. 10). Observou-se a ação da Tx3-4 (3 pmol/sítio), ω-ctx-MVIIC (3 pmol/sítio) e MK801 (30 nmol/sítio) de 0,25 a 4 horas após sua administração. A

ω-ctx-MVIIA não foi incluída no presente experimento uma vez que já existem estudos utilizando a mesma em modelo de nocicepção pós-operatória (Wang et al., 2000).

Tanto a Tx3-4, ω-ctx-MVIIC e MK801 foram capazes de reverter a alodínia mecânica previamente instalada com efeito de 80±12% para Tx3-4 e de 69±16% para MK801 em 1 hora e de 65±10% para ω-ctx-MVIIC em 0,25 h (Fig 10). Pode-se observar que a Tx3-4 e a ω-ctx-MVIIC apresentaram efeito antinociceptivo com doses até 10 vezes menores em relação àquelas utilizadas no teste da formalina, com pico de ação em intervalos de tempo próximos aos observados neste mesmo teste.

Figura 10. Efeito produzido pela injeção intratecal de Tx3-4 (3 pmol/sítio), MVIIC

(3 pmol/sítio) e MK801 (30 nmol/sítio). B, basal e PC, pós-cirurgia. Cada barra representa a média ± erro padrão de 6-8 animais. p< 0,01 para interação (ANOVA de 2 vias seguida pelo teste de Bonferroni). #p< 0,05 representa o nível de significância logo após a cirurgia quando comparado ao respectivo basal (Teste t de Student). *** p< 0,001, ** p< 0,01 e * p< 0,05 representam o nível de significância quando comparado aos animais tratados somente com PBS (5 L/sítio) para cada intervalo de tempo (ANOVA de uma via seguida pelo teste de Newmann-Keuls). B PC 0,25 0,5 1 2 4 0.01 0.1 1 10 PBS Tx3-4 (3 pmol) MK801(30 nmol/sítio) MVIIC (3 pmol/sítio) *** ** *** *** ** * * #

Nocicepção pós-operatória

_____________________

Te mpo após administração (h)

L

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5

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5. DISCUSSÃO

As síndromes dolorosas persistentes provocam sofrimento e estresse e seus mecanismos ainda não foram completamente elucidados (Woolf e Mannion, 1999). Seu controle ainda é um grande desafio porque algumas modalidades são refratárias aos analgésicos disponíveis, havendo assim a necessidade de novos fármacos, mais seletivos que não induzam tolerância ou dependência e que sejam capazes de tratar dores de difícil tratamento como, por exemplo, as neuropatias (Hogg, 2006).

É de conhecimento que os opióides são considerados os fármacos mais potentes utilizados no tratamento de dores agudas e crônicas, entretanto causam vários efeitos adversos como constipação, dependência, tolerância e depressão respiratória, o que restringe seu uso (Hoskin e Hanks, 1991; Martin e Sloan, 1977; McQueen, 1983; Nestler, 1993).

Este estudo teve como objetivo investigar a ação antinociceptiva da toxina Tx3-4, um peptídeo purificado do veneno da P. nigriventer, e avaliar seu potencial como possível agente analgésico. Sabe-se que um de seus mecanismos de ação é através da inibição de correntes de CCSVs principalmente do tipo-N e -P/Q e também –R (Dos Santos et al., 2002) e que o influxo de cálcio através dos CCSVs está envolvido na liberação de neurotransmissores e modulação da excitabilidade de membranas celulares (Zamponi e Snutch, 1998). Além disso, estudos farmacológicos, eletrofisiológicos e moleculares indicam que estes canais exercem importante papel no controle de processos nociceptivos na medula espinhal (Altier e Zamponi, 2004).

Os canais do tipo-N são conhecidos por sua atividade pró-nociceptiva nas duas fases do teste da formalina enquanto os do tipo-P/Q atuam principalmente na segunda fase (Malmberg e Yaksh, 1994). Este envolvimento dos CCSVs citados com nocicepção está em conformidade com a distribuição do tipo-N principalmente em dendritos e corpos celulares das lâminas II a IV e do tipo-P/Q

em terminações nervosas de fibras aferentes primárias no corno dorsal da medula e em dendritos e corpos celulares dos neurônios motores (Murakami et al., 2004). Assim, toxinas que interferem em CCSVs podem ser utilizadas para modular a liberação de neurotransmissores em condições dolorosas (Miljallich et al., 1995).

O veneno da P. nigriventer contém um coquetel de toxinas que afetam os canais iônicos, sendo os CCSVs alvo das toxinas Tx3-3, Tx3-4 e Tx3-6, derivadas da fração PhTx3 (revisado por Gomez et al., 2002). E assim justifica- se sua ação sobre vários sistemas fisiológicos, em particular aqueles relacionados com dor e inflamação (Costa et al., 2002, Souza et al., 2008).

Vários modelos de nocicepção foram utilizados para avaliar a atividade antinociceptiva da toxina Tx3-4, e ressalta-se que estes apresentam características próprias que devem ser consideradas tais como simplicidade, reprodutibilidade, validade dos resultados e possibilidade de serem correlacionados com estudos clínicos (Besson, 1999; Le Bars et al., 2001).

Iniciamos os experimentos através do teste da placa quente por este ser um teste simples e de curta duração. Seu objetivo é mensurar a resposta nociceptiva a um estímulo térmico breve que ativa nociceptores que transmitem a informação nociva ao corno dorsal da medula e posteriormente a centros corticais, produzindo uma resposta organizada (Mogil e Adhikari, 1999). A placa quente é um dos modelos mais utilizados no estudo de fármacos analgésicos, principalmente de substâncias que possuem ação no SNC, como os opióides (Le Bars et al., 2001).

Apesar da incapacidade de bloqueadores de canais tipo-P/Q atuarem no teste da placa quente, acreditava-se que Tx3-4 poderia ter efeito uma vez que bloqueadores de CCSVs do tipo-N apresentaram efeito ao inibir o estímulo nocivo térmico (Hatakeyama et al., 2001; Malmberg e Yaksh, 1994). A Tx3-4 não apresentou efeito antinociceptivo no presente teste assim como a ω-ctx-MVIIC, o que já era esperado para bloqueadores seletivos tipo-P/Q. Essa conotoxina foi escolhida em detrimento a ω-ctx-MVIIA uma vez que sua atividade como

camundongos assim como da Phα1β (Souza et al., 2008). Desta forma, optamos por utilizar a morfina tanto como controle positivo quanto como forma validar esses achados. Uma das possíveis explicações para ausência de efeito da Tx3- 4 seria a alta temperatura, 55±0,5ºC, disfunções motoras leves ou pequena participação do bloqueio de CCSVs tipo-N. A temperatura foi escolhida uma vez que peptídeos derivados de animais são utilizados para substituir opióides ao tratar dores refratárias aos mesmos (Hogg, 2006), sendo esta última, a única classe de fármacos conhecida capaz de apresentar efeito a estímulo térmico de tal intensidade. Já quanto aos efeitos motores, doses de Tx3-4 e ω-ctx-MVIIC inferiores a 30 pmol/sítio foram administradas (dados não mostrados) e também se mostraram igualmente ineficazes para aumentar a latência dos animais testados. Assim resta a última possibilidade, o que não deporia contra o potencial terapêutico da Tx3-4, pois o tipo de nocicepção induzida pela placa representa uma importante função protetora na manutenção da integridade dos tecidos e deve ser evitado em certas circunstâncias.

Diante da ineficiência das duas toxinas no teste anterior, partimos para o modelo de nocicepção induzida pela injeção intraplantar de formalina, que é uma das ferramentas mais utilizadas na triagem de novos compostos com potencial analgésico (Hunskaar e Hole, 1987; McNamara et al., 2007). O teste da formalina é caracterizado por produzir um comportamento bifásico, com transição da fase neurogênica, primeira fase, para a fase inflamatória, segunda fase ou estado de nocicepção persistente. Trata-se de um teste de nocicepção por estímulo químico, sendo que a fase neurogênica envolve principalmente a participação de fibras aferentes do tipo C (Tjolsen et al., 1992) e a fase inflamatória envolve o estímulo contínuo proveniente da primeira fase além da liberação de mediadores neuroativos (Ji e Woolf, 2001; Vanegas e Schaible, 2004). Já o período entre as duas fases, que se estende aproximadamente de 5 a 15 minutos após a injeção da formalina, apresenta perfil de redução do comportamento nociceptivo devido a ativação de vias descendentes inibitórias (Millan, 2002; Vanegas e Schaible, 2004).

A diferença entre os mecanismos de nocicepção das fases aguda e inflamatória pode permitir caracterização do perfil de um novo fármaco, por exemplo, os AINES que ficaram conhecidos por atuarem na segunda fase do teste da formalina, o que indicava potencial terapêutico em dores de origem inflamatória. Hoje já se sabe que seu mecanismo de ação analgésica é devido a inibição da síntese de prostaglandinas, presente na fase inflamatória do teste e em outros estados de inflamação (Dirig et al., 1997). Realizamos administração prévia de Tx3-4, de ω-ctx-MVIIC, como controle para ativação de CCSVs tipo- P/Q, e de ω-ctx-MVIIA como controle para ativação de CCSVs do tipo-N, e todas as toxinas, com exceção da segunda, apresentaram ação na fase inflamatória no pré-tratamento. Já no pós-tratamento, apenas a Tx3-4 e a ω-ctx- MVIIC apresentaram efeito na fase inflamatória.

Normalmente, bloqueadores de canais tipo-N inibem a fase neurogênica em concentrações superiores as necessárias para inibir a fase inflamatória (Diaz e Dickenson, 1997; Malmberg and Yaksh, 1994) e apresentam preferência pelo CCSV tipo-N no estado inativado (Stocker et al., 1997). Ressalta-se a opção por uma dose baixa de ω-ctx-MVIIA neste estudo, uma vez que doses superiores a 3 pmol/sítio já apresentariam potencial para alterar as respostas motoras de camundongos no teste do “rotarod” (Malmberg et al., 2003). Assim, a atividade da ω-ctx-MVIIA apenas na segunda fase do pré-tratamento no teste da formalina condiz com os achados de outros autores e justifica-se pela baixa dose administrada e por sua preferência por canais inativados.

Sabe-se que bloqueadores de canais do tipo-P/Q quando pré- administrados, até dez minutos antes da injeção de formalina, atuam principalmente na fase inflamatória, e a eles credita-se função de manutenção da nocicepção (Diaz e Dickenson, 1997; Malmberg and Yaksh, 1994) o que indica a participação deste tipo de CCSV nesta fase. Assim, sugere-se que uma justificativa plausível para ação da ω-ctx-MVIIC apenas no pós-tratamento seria que nesta condição, haveria aumento da proporção de CCSVs em estado aberto disponíveis para ligação com este peptídeo.

A toxina Tx3-4 apresentou perfil intermediário entre as ω-ctxs MVIIC e MVIIA, com inibição das fases inflamatórias tanto no pré- quanto no pós- tratamento, demonstrando potencial analgésico em modelos de nocicepção inflamatória. Entretanto, optamos primeiramente por determinar o DT50 da Tx3-4

e excluir possíveis comprometimentos motores em animais que receberam as doses mais altas desta, ω-ctx-MVIIC e ω-ctx-MVIIA antes de continuar a investigar seu potencial terapêutico.

Como previamente descrito, observamos que doses superiores a 50 pmol/sítio causavam paralisia flácida da cauda e patas traseiras, e alteração discreta do padrão respiratório. Sugerimos que isto tenha ocorrido através do bloqueio de CCSVs do tipo-P/Q presentes nos corpos celulares e dendritos de neurônios motores das lâminas ventrais da medula (Murakami et al., 2004), e que esta resposta seria localizada. Entretanto, não é possível afirmar se a Tx3-4 poderia se difundir e alcançar estruturas superiores do SNC. Assim, estudos com marcação fluorescente e acompanhamento da difusão das moléculas de Tx3-4 fazem-se necessários para esclarecer os mecanismos para o desenvolvimento de toxicidade em altas doses.

O cálculo do DT50 revelou um baixo índice terapêutico, entretanto a Tx3-4

não apresentou efeitos colaterais como incoordenação motora ou alteração da atividade locomotora em um campo aberto com a dose testada (30 pmol/sítio). O contrário se observou para ω-ctx-MVIIC, que provocou alterações no campo aberto comparada ao PBS, Tx3-4 e até ω-ctx-MVIIA. Segundo Malmberg (1994), os bloqueadores de CCSV do tipo-N causam principalmente tremor e serpenteado de cauda enquanto os do tipo-P/Q causam paralisia flácida da cauda e patas traseiras. Apesar da alta afinidade da Tx3-4 tanto pelos CCSVs tipo-N quanto –P/Q (Dos Santos et al., 2002), credita-se aos últimos o aparecimento de paralisia flácida, uma vez que camundongos homozigotos com mutação espontânea que reduz a sensibilidade de ativação destes canais, “rolling mouse Nagoya”, apresentam incoordenação motora das patas traseiras (Fukomoto et al., 2009).

Excluídos os efeitos colaterais nas doses testadas, investigamos o perfil farmacológico da Tx3-4 e concluímos que sua atividade antinociceptiva coincidia com estados de sensibilização central. Sabe-se que a atividade do receptor NMDA contribui para manutenção deste processo (Ferreira e Lorenzetti, 1994; Haley et al., 1990; Ren et al.,1992) que também está presente no teste da formalina. Além disso, observamos que o perfil da Tx3-4 se assemelha ao do MK801, inibidor não-competitivo do receptor NMDA (Hamada et al., 2001). Então, testamos o efeito da phonotoxina em modelo de nocicepção induzida pela administração intratecal do NMDA, utilizamos MK801 como controle e observamos que a Tx3-4 não só apresentou efeito, mas com dose de 10 pmol/sítio. Esses achados sugerem que a Tx3-4 poderia apresentar afinidade por outros alvos além dos CCSVs, o que não seria surpresa, pois Reis e colaboradores (1999) evidenciaram que esta inibe a liberação de glutamato pela reversão do transportador, mecanismo independente de Ca2+, em terminações nervosas de ratos. Uma possibilidade seria uma interação direta com o receptor NMDA já que a ω-conotoxina-GVIA e a ω-agatoxina-VIA (1 a 10 pmol/sítio), bloqueadoras de CCSVs tipo-N e –P/Q respectivamente, falharam neste modelo (Kato et al., 2002) e já existe uma toxina, a conotoxina-G, capaz de bloquear os receptores NMDA que contém a subunidade NR2B (Hama e Sagen, 2009; Malmberg et al., 2003). Entretanto, não se pode excluir de todo a participação dos CCSVs tipo-P/Q no modelo de nocicepção por NMDA pois a ω-agatoxina- IVA se liga a uma região que envolve o aparato de “gating” mas que não se sobrepõe à região de ligação dos bloqueadores do poro como a ω-ctx-MVIIC (Mcdonough et al., 2002). Assim, faz-se necessária a utilização da conotoxina no presente modelo para excluir a participação dos CCSVs citados e realização de experimentos “in vitro”, como “binding” em receptor NMDA, para esclarecer se este alvo está envolvido no mecanismo de ação da Tx3-4.

Como a Tx3-4 apresentou efeito antinociceptivo em modelos em que havia envolvimento de sensibilização central, o próximo passo seria testá-la em modelos semelhantes que fossem clinicamente relevantes. O modelo de dor

ferramenta amplamente utilizada em estudos experimentais de nocicepção pós- operatória já que é bastante similar a dor pós-cirúrgica e uma vez que as variáveis podem ser melhor controladas em modelos experimentais animais. (Brennan et al., 1996; Pogatzki e Raja, 2003).

A resposta nociceptiva pode ser mensurada através do aumento da sensibilidade dolorosa a estímulos nocivos, hiperalgesia, ou a estímulos inóquos, alodínia. Estes fenômenos ocorrem devido à ação direta e/ou indireta de um conjunto de mediadores inflamatórios sendo que a hiperalgesia inflamatória é resultante do aumento da excitabilidade (sensibilização) das fibras aferentes primárias nocivas enquanto a alodínia resulta da interpretação do estímulo mecânico como nocivo pelas fibras Aβ, de baixo limiar mecânico. Sabe- se que administração oral de antiinflamatórios não-esteroidais reduz a hiperalgesia e a alodínia mecânica induzida pela incisão plantar em ratos (Whiteside et al., 2004) e que neste modelo, o perfil farmacológico de diferentes analgésicos parece ser muito similar ao encontrado na clínica.

A administração da Tx3-4 reverteu a alodínia mecânica decorrente da incisão, com perfil farmacológico semelhante ao do teste da formalina, apesar de ter sido 10 vezes mais potente. Sua eficácia foi superior à da ω-ctx-MVIIC, e do MK801, o que corrobora para a atividade em diferentes alvos. A ω-ctx-MVIIC, por sua vez, apresentou pico de ação aos 15 minutos e esta perdurou até 1 hora e baseando-se em estudos prévios (Stocker et al., 1997) seria difícil associar essa atividade a afinidade por CCSVs do tipo-N em estados ativados. A partir dos resultados obtidos no modelo de nocicepção optamos por usar o MK801 como novo controle e este apresentou perfil farmacológico semelhante a Tx3-4. Estes achados foram um tanto quanto surpreendentes, uma vez que o próprio autor do modelo de nocicepção pós-cirúrgica constatou através de estudos em ratos, que o receptor NMDA não contribuiria para manutenção das respostas nociceptivas desenvolvidas (Zahn et al., 1998).

Chamamos atenção para o fato de que este estudo foi realizado com camundongos e muitas das fontes consultadas utilizaram outras espécies além de roedores tanto “in vivo” quanto “in vitro”. A potência terapêutica e atoxicidade

podem variar entre as diferentes espécies e sabe-se que os efeitos adversos de vários fármacos são verificados de maneira mais precisa em cães do que em roedores (Greaves et al., 2004). Outro ponto a ser ressaltado é que toxinas como a Phα1β e a Tx3-4 poderão, no futuro, ser ferramentas úteis no combate a dores refratárias à morfina assim como a ω-ctx-MVIIA (Ziconotida), que já é utilizada no tratamento da dor associada ao câncer e ao vírus da SIDA, sendo 1000 vezes mais potente que a morfina além de não causar tolerância nem dependência associada aos opióides (Hogg, 2006).

6. CONCLUSÃO

Baseando-se nos resultados apresentados pode-se concluir que:

-A toxina Tx3-4 não apresenta efeito antinociceptivo no teste de nocicepção térmica transitória, placa quente;

-A toxina Tx3-4 produziu efeito antinociceptivo nos modelos de nocicepção química persistente, nocicepção espontânea induzida por NMDA e nocicepção incisional;

- A toxina não altera a coordenação ou atividade locomotora de camundongos nas doses testadas.

7. PERSPECTIVAS

Para melhor elucidar os mecanismos da atividade antinociceptiva e da toxicidade apresentada pela Tx3-4 faz-se necessário a realização de mais experimentos com os seguintes objetivos:

-Avaliar a atividade da ω-ctx-MVIIC no modelo de nocicepção induzida pelo NMDA;

-Verificar a possível afinidade da toxina pelo receptor NMDA através de experimento de “binding”;

-Avaliar efeito antinociceptivo da toxina em outros modelos clinicamente relevantes (dor relacionada à neuropatia e ao câncer);

-Realizar marcação fluorescente das moléculas de Tx3-4 e verificar sua possível difusão pelo líquor.