Avaliação da atividade antioxidante

2.2.5.1 Atividade sequestrante do radical livre (DPPH) e o EC50

A metodologia do DPPH descrita conforme o item 2.2.3, foi utilizada para medir a capacidade antioxidante dos solventes escolhidos etanol:água O80:20 v/v) e água destilada.

O radical DPPH reage rapidamente com alguns fenóis, mas existem reações secundárias que atuam concomitantemente, ocorrendo de forma lenta causando um progressivo decréscimo

na absorbância, podendo demorar algumas horas para que a reação seja estabilizada. Sendo assim, uma melhor interpretação dos resultados do método do DPPH é por meio do EC50, o qual é definido como a concentração de substrato que reduz em 50% o radical DPPH Ocor) inicial da reação. Esse parâmetro foi aparentemente introduzido por BrandJWilliams e colaboradores OBRANDJWILLIAMS; CUVELIER; BERSET, 1995; BONDET; BRANDJWILLIAMS; BERSET, 1997) e indica que quanto maior a atividade antioxidante, mais baixo é o valor de EC50.

Os valores do EC50 foram calculados por regressão linear dos gráficos em que o eixo das abscissas representou a concentração dos extratos e o eixo das ordenadas a atividade antioxidante O%) calculada segundo a Equação 1. A cinética dos extratos dos vegetais foi determinada por meio do monitoramento a cada 20 minutos, durante 120 minutos, do declínio da absorbância da solução de DPPH a 517 nm. As concentrações utilizadas na reação foram calculadas a partir do extrato bruto 10% para o solvente etanol:água O80:20 v/v) O1,0 g resíduo vegetal liofilizado/10 mL de solvente) e o extrato bruto 5% para a solvente água O1,0 g resíduo vegetal liofilizado/20 mL de solvente) e submetidas à reação.

2.2.5.2 Atividade antioxidante pelo método ABTS

A atividade antioxidante pelo método ABTS [2,2JazinoJbisJO3JetilbenzotiazolinaJ6Jácido sulfônico)] foi feita conforme metodologia descrita por Rufino et al. O2007). O radical ABTS• + foi formado pela reação de ABTS 7 mM com persulfato de potássio 140 mM, incubado à temperatura de 25 ºC, em ambiente escuro, durante 16 horas. Uma vez formado o radical foi diluído com etanol 99% até a obtenção do valor de absorbância de 0,700 ± 0,200 a 734 nm.

A partir dos extratos dos resíduos vegetais obtidos com os melhores solventes e preparados conforme o item 2.2.2, foi preparado três diluições diferentes em triplicata. Em ambiente escuro, um volume de 3,0 mL da solução de radical ABTS• + foi acrescentado a 30_L de cada diluição dos extratos, e, as absorbâncias lidas após seis minutos da reação em espectrofotômetro a 734 nm, utilizando o etanol 99% como branco. Foi utilizado como referência o Trolox O6JHidroxiJ2,5,7,8JtetrametilcromanoJ2Jácido carboxílico), um antioxidante sintético análogo à vitamina E, nas concentrações de 100 a 2000 _M OApêndice 2). Os resultados da atividade antioxidante foram expressos em _M trolox/g de resíduo vegetal.

2.2.5.3 Autoxidação do sistema betaBcaroteno/ácido linoléico

A medida da atividade antioxidante pela oxidação acoplada do betaJcaroteno e do ácido linoléico foi realizada de acordo com o método de Emmons, Peterson e Paul O1999). Foram pesados inicialmente 10 mg de betaJcaroteno, que foram dissolvidos em 100 mL de clorofórmio. Após isto, foi retirada uma alíquota de 3 mL da solução clorofórmio/betaJcaroteno e adicionouJse 40 mg de ácido linoléico e 400 mg de Tween 40. Em seguida, o clorofórmio foi removido com a utilização de uma corrente de gás nitrogênio e o resíduo obtido foi redissolvido em 100 mL de água aerada durante 30 minutos. Alíquotas de 3 mL da emulsão betaJcaroteno/ácido linoléico foram misturadas com 50 _L dos extratos dos resíduos vegetais obtidos com os melhores solventes, todos diluídos na razão de 1:10, e incubadas em banhoJmaria a 50 ºC. A oxidação da emulsão foi monitorada em espectrofotômetro a λ=470 nm, no tempo inicial e em intervalos de 20 minutos durante duas horas. Para a amostra controle utilizouJse solvente etanol 80% e água destilada no lugar do extrato dos resíduos vegetais. Como controle positivo foi utilizado padrão de BHT na concentração de 100 ppm.

A atividade antioxidante OAA) foi expressa como percentual de inibição relativa comparada ao controle depois de 120 minutos utilizandoJse a Equação 2:

Onde:

DRc = taxa de degradação do controle O= lnOa/b)/120)

DRs = taxa de degradação na presença do padrão ou extrato O= lnOa/b)/120)

“a“ e “b” são as absorbâncias no tempo inicial O0 min) e no tempo final O120min), respectivamente.

2.2.5.4 Estabilidade oxidativa B método Rancimat

O método Rancimat foi realizado de acordo com o descrito por Murcia, Jiménez e MatínezJTomé O2001). Inicialmente, pesouJse 5 gramas de óleo de soja Ofornecido pela Empresa Cargill Agrícola S/A) isento antioxidantes, sendo misturados com os extratos etanólico dos resíduos vegetais, na concentração de 100 ppm, calculado com base no teor de compostos fenólicos. Em relação aos extratos aquosos, primeiramente foram liofilizados e ressuspendidos O2)

em etanol:água O80:20 v/v). Novas análises do teor de compostos fenólicos totais foram feitas, para se preparar uma concentração de 100 ppm. Em seguida a mistura foi submetida a uma temperatura de 110 ± 1 ºC, sob fluxo de ar seco constante a taxa de 9 L/h, conforme o método cd 12bJ92 OAOCS, 2003) em equipamento Rancimat 743 OMetrohm AG, CHJ9100 Herisau Switzerland).

A determinação do período de indução OPI) ou índice de estabilidade oxidativa foi baseada nas leituras de condutividade crescente em função da detecção do acúmulo de compostos de oxidação, que permitiram a formação de uma curva em função do tempo de reação. O controle foi preparado com óleo de soja sem antioxidante, e amostras contendo antioxidante sintético BHT na concentração de 100 ppm foram submetidas a essa análise, para efeitos de comparação com os extratos dos resíduos vegetais analisados.

A atividade antioxidante foi expressa pelo Fator de Proteção OPF), usando a Equação 3:

Onde:

PIa = Período de indução do óleo com os extratos ou padrões

PIc = Período de indução do controle Oóleo sem os extratos ou padrões)

2.2.5.5 Poder antioxidante de redução do ferro (FRAP)

Para a determinação da atividade antioxidante foi utilizada a metodologia do FRAP OFnrric Rnducing Antioxidant Pownr) – Poder Antioxidante de Redução do Ferro. Este método foi uma alternativa desenvolvida para determinar a redução do ferro em fluidos biológicos e soluções aquosas de compostos puros, podendo ser aplicado para estudos da atividade antioxidante em extratos de alimentos, bebidas e para o estudo da eficiência antioxidante de substâncias puras, com resultados comparáveis àqueles obtidos com outras metodologias mais complexas OPULIDO; BRAVO; SAURAJCALIXTO, 2000).

Os antioxidantes presentes no extrato vegetal são avaliados como redutores do Fe+3 a Fe+2, sendo quelados por 2,4,6JTriO2JPiridil)JsJTriazina OTPTZ), para formar o complexo Fe+2JTPTZ Ocor azul) com absorção máxima em λ=593 nm OBENZIE; STRAIN, 1996).O poder antioxidante de redução do ferro é uma alternativa para a determinação da redução do ferro. O reagente de

FRAP foi preparado misturandoJse (a) tampão acetato de sódio 300 mM a pH 3,6; (b) solução de 2,4,6JtripiridilJsJtriazina OTPTZ) 10mM em HCl 40 mM; (c) solução de cloreto férrico 20mM. Para obter o reativo FRAP os reativos a, b e c foram misturados na proporção de 10:1:1 no momento da análise. Como padrão foi utilizado o sulfato ferroso heptahidratado. Em um tubo de ensaio foram adicionados 3 mL do reagente FRAP, 100 ]L do padrão ou do extrato do resíduo vegetal dos melhores solventes e incubados durante 30 minutos a 37 °C. A leitura da absorbância foi feita a 593 nm, o reagente do FRAP foi utilizado como branco. O padrão de sulfato ferroso heptahidratado foi utilizado para a construção de uma curva com diferentes concentrações que variaram de 100 a 2000 _M OApêndice 3). Os resultados da atividade antioxidante serão expressos em ]M sulfato ferroso/g de resíduo vegetal Oatividade antioxidante equivalente ao sulfato ferroso heptahidratado). Todas as análises foram realizadas em triplicata.