Avaliação da atividade citotóxica in vitro

3.3.2.1 Linhagens e modelos celulares

As linhagens tumorais utilizadas para avaliação da atividade antiproliferativa foram obtidas a partir de doação pelo Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (US-NCI), enquanto a linhagem 3T3-L1 foi obtida a partir do banco de células do Rio de Janeiro (BCRJ). As células mononucleadas de sangue periférico (CMSP) obtidas de voluntários sadios foram utilizadas como modelo para avaliação da citotoxicidade sobre células humanas normais (Tabela 1).

3.3.2.2 Manutenção das linhagens celulares

As linhagens celulares foram manuseadas em ambiente estéril de câmara de fluxo laminar vertical (VECO, modelo Biosafe 12, classe II) e mantidas em incubadora de CO2 a 37

°C com atmosfera de 5% de CO2 (NUAIRE, modelo TS Autoflow).

As linhagens celulares foram cultivadas em frascos plásticos para cultura (25 cm2, volume de 50 mL ou 75 cm², volume de 250 mL, Corning), utilizando o meio de cultura (Gibco) adequado para cada linhagem (Tabela 1) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (para uma concentração final de 100 U/mL penicillina e 100 g/mL estreptomicina).

As culturas tiveram seu crescimento acompanhado sob microscópio óptico de inversão (ZEISS, modelo Axiovert 40C) a cada 24 horas. Quando necessário, as células foram repicadas em meio de cultura novo, numa concentração de 0,5-1,0 x 106 células/mL. Para o desprendimento das células aderidas foi utilizado solução de tripsina-EDTA 0,5% (Gibco) diluída 10X em PBS.

Tabela 1 ˗ Linhagens celulares utilizadas no ensaio de MTT Linhagem

celular Doença Origem Meio de cultivo

HCT-116 Carcinoma colorretal Humana RPMI

COLO 205 Adenocarcinoma colorretal Humana RPMI

SW 620 Adenocarcinoma colorretal Humana RPMI

HL-60 Leucemia promielocítica aguda Humana RPMI

K562 Leucemia mielóide crônica Humana RPMI

MALME-3M Melanoma Humana IMDM

M14 Melanoma Humana RPMI

MCF-7 Adenocarcinoma mamário Humana RPMI

MDAMB-231 Adenocarcinoma mamário Humana RPMI

OVCAR-8 Carcinoma ovariano Humana RPMI

PC-3M Adenocarcinoma de próstata Humana RPMI

SF-295 Glioblastoma Humana RPMI

CMSP Células mononucleadas de sangue

periférico Humana RPMI

3T3-L1 Fibroblastos não transformados Murino DMEM

V 79 Fibroblastos não transformados

Hamster

3.3.2.3 Obtenção das células mononucleadas do sangue periférico (CMSP)

As células mononucleadas foram obtidas do sangue periférico de voluntários sadios coletado em tubos tipo Vacutainer contendo solução de EDTA K2 (BD Vacutainer®) como

anticoagulante. Após a coleta, 5mL de sangue total foram diluídos em PBS (1:1) e vagarosamente depositados sobre 2 mL de Ficoll®-Hypaque (Sigma). Posteriormente foi realizada a centrifugação por 30 minutos a 1500 rpm para separação das fases da solução. As células mononucleadas concentram-se na camada localizada na interface entre o plasma (fase clara) e os eritrócitos (fase escura). As CMSP foram transferidas para outro tubo ao qual foram acrescido PBS até o volume final de 11 mL, sendo então centrifugado por 20 minutos a 1000 rpm. Esse procedimento foi repetido e o pellet de CMSP foram ressuspendido em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos (para uma concentração final de 100 U/mL penicillina, 100 g/mL estreptomicina). Para estimular a proliferação dos linfócitos, foi adicionado ao meio 2% do agente mitogênico fito- hemaglutinina (Sigma). As células foram contadas e diluídas para uma concentração final de 1 x 106 células /mL.

3.3.2.4 Teste de citotoxicidade - Teste do MTT

Princípio do Teste

O ensaio consiste em uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5- dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazólio (MTT) para formazan, pela atividade da enzima succinil-desidrogenase presente nas mitocôndrias de células viáveis (MOSMANN, 1983), permitindo, dessa maneira, quantificar indiretamente a porcentagem de células vivas.

Procedimento Experimental

As células foram distribuídas em multiplacas de 96 cavidades em densidade de 0,1 x 106 células/mL para células aderidas e 0,3 x 106 células/mL para células em suspensão. As células foram incubadas por 69 horas juntamente com a amostra testada em concentrações seriadas (0,39 - 25µg/mL). Após o período de incubação, as placas foram centrifugadas (1500 rpm/15 min), e o sobrenadante foi descartado. Cada cavidade recebeu 150 µL da solução de MTT (10% em meio RPMI 1640) e foi reincubada por mais 3 horas em estufa a 37°C e a 5% CO2. Após esse período, as placas foram novamente centrifugadas (3000 rpm/10 min), o

quantificação do sal reduzido (formazan) pelas células vivas. As absorbâncias foram obtidas com o auxílio do espectrofotômetro de placa (Beckman Coulter Inc., modelo DTX-880) utilizando o programa Multimode Detection Software (Beckman Coulter Inc.) no comprimento de onda de 595 nm.

Para a análise do efeito tempo-dependente, este método também foi realizado após 24 e 48 horas de tratamento com o diterpeno HCRH na linhagem HCT-116.

Análise dos Dados

Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos erros-padrão. O gráfico absorbância x concentração foi registrado e determinado a sua concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo (CI50) e seus respectivos intervalos de

confiança de 95 % (IC 95 %) realizado a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism Software versão 5.0.

3.3.2.5 Ensaio antiproliferativo - Incorporação do BrdU

Princípio do Teste

A bromodeoxiuridina (BrdU) é uma base nitrogenada análoga a timina. Assim, quando as células estão sintetizando seu DNA, o BrdU é incorporado no lugar da timina. A detecção do BrdU incorporado nas células é feita por técnicas imunohistoquímicas (PERA et al., 1977).

Procedimento Experimental

O BrdU foi adicionado 3 horas antes do término do período de incubação com a droga (21h), a fim de ser incorporado ao DNA das células em mitose. Após o tempo de incubação, as células foram tripsinizadas, as lâminas foram preparadas em citospin com 80µL da suspensão de células e colocadas para secar ao ar livre por 2 horas. Após a secagem, as células foram fixadas em metanol por 1 minuto. As células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em solução desnaturante (formamida) por 90 minutos a 70ºC e pH 7,4. Após uma segunda lavagem com TBS, as células foram circuladas com caneta hidrofóbica e incubadas com anticorpo primário por 120 minutos em estufa bacteriológica em câmara úmida. As células foram incubadas com anticorpo secundário biotinado por 20 minutos e, em seguida, com a solução de estreptavidina-fluoresceína por mais 20 minutos. Foi adicionado o

cromógeno diaminobenzidina (DAB) por aproximadamente 1minuto e em seguida, removido com água destilada. A contracoloração foi realizada com hematoxilina de Harrys a 0,1% (PERA et al., 1977).

Análise dos Dados

Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo marrom (incorporaram o BrdU) e não-marrom (não incorporam o BrdU). Os dados foram expressos como da média ± E.P.M. de 3 experimentos independentes (n = 9). A proporção de células marcadas em marrom e não-marcadas entre os diferentes grupos foi comparada por análise de variância (ANOVA) seguido por Teste Student Newman Keuls com nível de significância de 5 % (p < 0,05) usando o programa GraphPad (Intuitive Software for Science, San Diego, CA).