Avaliação da citotoxidade através de métodos in vitro

Para avaliação de toxicidade de compostos, métodos in vivo e in vitro podem ser utilizados. O amplo interesse público e científico em promover o cuidado e bem dos animais utilizados para testes de toxicidade levou a significativas melhorias nas práticas de bem-estar animal, bem como leis e regulamentos que visem reduzir, refinar e substituir (conhecido como 3 Rs – do inglês “Refine, Reduce, Replace”) o uso de animais em testes de toxicidade (FORD, 2016). As metodologias in vitro possuem muitas vantagens, uma vez que são mais rápidas, baratas, convenientes, além de possuírem menos questões éticas envolvidas do que as metodologias in vivo (FARD, JAFARI & EGHBAL, 2015). Com esta finalidade, comitês nacionais e internacionais foram criados com o objetivo de organizar a validação de métodos alternativos, como o ECVAM (European Centre for The Evaluation of Alternative Methods) na Europa, e o ICCVAM (The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) nos EUA. Dentre todos os métodos reconhecidos pelas

agências regulatórias, linhagens celulares como BALB/c 3T3 (fibroblastos murinos) ou NHK (queratinóticos humanos normais) consistem em substratos celulares muito conhecidos para testes de citotoxicidade in vitro (OECD, 2010).

Dados de toxicidade aguda são exigidos por quadros normativos regulatórios a fim de fornecer advertências para classificação de risco e rotulagem e para entender sobre possíveis consequências após a exposição a substâncias como produtos químicos industriais, biocidas, pesticidas, ingredientes cosméticos e produtos farmacêuticos (ECCVAM, 2018). Além disso, a avaliação de toxicidade oral aguda consiste tipicamente no primeiro passo para a identificação e caracterização dos perigos causados por substâncias químicas (ICCVAM, 2001). O valor de DL50, definido como a dose que leva a morte de

50% dos animais em um determinado período de tempo, é a atualmente a base para a classificação toxicológica de químicos (WALUM, 1998). Assim, a avaliação da toxicidade sistêmica oral é recomendada para qualquer tipo de substância que será destinada para fins de saúde, incluindo NPs.

Porém, muito embora o teste de toxicidade oral aguda seja um requisito padrão para fins regulatórios, a realidade que encontramos hoje é a proibição de testes em animais para determinados produtos (como cosméticos) e a busca intensa pela redução do uso de animais para outros produtos (produtos químicos industriais) (PRIETO et al., 2013).

Para a predição de toxicidade oral aguda in vitro e com o objetivo de reduzir o número de animais para classificação e rotulagem de químicos, metodologias já padronizadas e validadas existem e já são implementadas no mundo todo. A OECD Guideline no. 129 consiste em um documento guia para testes de citotoxicidade que visa estimar as doses iniciais para os ensaios de toxicidade oral aguda através do ensaio de captação do vermelho neutro (OECD, 2010). A partir deste ensaio, é possível, através de metodologia in vitro, predizer a DL50 (dose letal 50%). Uma vez predita a DL50, é possível então predizer a

classificação da substância avaliada como pertencente da categoria 1 a categoria 6 de toxicidade GHS (ICCVAM, 2006), conforme a tabela 1.2. O grande objetivo desta metodologia é reduzir o número de animais utilizados para testes de toxicidade oral aguda (STOKES et al., 2008), uma vez que os testes de DL50

tradicionais estão sendo cada vez mais desencorajados enquanto novos métodos estão sendo desenvolvidos e endossados pelos órgãos relatórios

(ERHIRHIE et al., 2018). Classe GHS: DL50 Categoria 1 DL50 ≤ 5 mg/kg Categoria 2 5 ˂ DL50 ≤ 50 mg/kg Categoria 3 50 ˂ DL50 ≤ 300 mg/kg Categoria 4 300 ˂ DL50 ≤ 2000 mg/kg Categoria 5 2000 ˂ DL50 ≤ 5000 mg/kg Categoria 6 DL50 ˃ 5000 mg/kg

Tabela 1. 2: Categorias GHS e seus respectivos valores de DL50.

As células BALB/c 3T3 consistem em uma das principais linhagens celulares utilizadas para estimar as doses iniciais dos testes de toxicidade sistêmica oral aguda (ICCVAM, 2001, OECD 423). As células BALB/c 3T3 tem sido muito utilizadas para avalição de toxicidade (ABUD et al., 2015; HROUZEK et al., 2016; THORNE et al., 2014), inclusive para avaliação da citotoxicidade de NPs (MANNERSTRÖM et al., 2016; STOCCORO et al., 2016; UBOLDI et al., 2016). Estudos já demonstraram que células BALB/c 3T3 são mais precisas na avaliação de toxicidade in vitro quando comparadas a outras linhagens como Caco-2, HepaRG, HepG2, HeLa e hepatócitos (BROEDERS, BLAAUBOER, & HERMENS, 2013; HROUZEK et al., 2016). Broeders e colaboradores (2013) e Hrouzek e colaboradores (2016) compararam as respostas de células 3T3 com outros tipos celulares em relação a avaliações de citotoxicidade e constataram que as células 3T3 foram as mais sensíveis e acuradas para avaliação de citotoxicidade in vitro. Sendo assim, a utilização destas células para a avaliação da toxicidade de NPs pode representar uma abordagem bastante interessante e um modelo possível para a avaliação de risco de NPs.

Em um documento recente da OMS (LEE et al., 2017), elaborou-se um documento visando estabelecer guias relacionados a saúde ocupacional de trabalhadores expostos a NPs para 11 nanomateriais que são amplamente produzidos e que tiveram estudos conduzidos de acordo com as normas da OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development), como NPs de sílica, óxido de zinco, prata, dióxido de titânio, dentre outros. Como conclusão,

de acordo com o tipo de NP, a categorização de risco muda. Desta forma, é importante avaliar cada nanomaterial quanto ao seu potencial tóxico.

Devido à grande diversidade de propriedades físico-químicas de NPs, bem como da vasta complexidade dos sistemas de avaliação, há uma grande necessidade da elaboração de estratégias avançadas e altamente acuradas para estudar as interações NP-células, bem como a toxicidade. Técnicas multidisciplinares utilizando desde ferramentas in silico a avaliações in vivo devem ser elaboradas para a avaliação dos possíveis efeitos colaterais associados a NPs. Através da utilização de estratégias realmente apropriadas que permitam a avaliação de risco para tomada de decisão com um melhor entendimento será possível trazer melhores resultados, auxiliando a projetar NPs ambientalmente amigáveis e biologicamente seguras (JAIN et al., 2018). Neste contexto, no presente trabalho o nosso grupo buscou partir de 4 diferentes nanopartículas de interesse para elaboração de produtos para saúde, avaliá-las quanto as características físico-químicas e interação com sistemas biológicos, avaliando citotoxicidade, efeitos celulares a nível ultra-estrutural e mecanismos de morte celular.