photobiomodulation therapy
5.13 Avaliação da dinâmica de cálcio intracelular
5.13.1 Experimento ex vivo: dinâmica intracelular de cálcio em neurônios dos GRDs L4-L5 de ratos diabéticos neuropáticos submetidos à LLLT
Foi realizado ensaio da dinâmica de cálcio intracelular Δ[Ca2+]i em cultura primária de neurônios dos GRDs L4-L5, coletados a partir de ratos dos grupos SCB, STZ e STZ+LLLT, no 28º dia do protocolo experimental. O ensaio foi realizado sob estímulo com diferentes concentrações de potássio ↑[K+]e [KCl 5 mM (basal), 15 mM e 50 mM], por meio de um sistema automatizado de válvulas. Foi observado pico de fluorescência, atribuído à ligação do Fluo-4, AM, ao cálcio intracelular, nos três grupos (SCB, STZ e STZ+LLLT) após estímulo com alta concentração de potássio (KCl 50 mM), conforme observado na Figura 43, Painéis C, F e I.
Figura 43. Imagens representativas das fluorescências durante os incrementos da concentração de KCl no meio extracelular. As placas de cultura primária de neurônios dos GRDs L4-L5 de ratos dos grupos SCB (Painéis A, B e C), STZ (Painéis D, E e F) e STZ+LLLT (Painéis G, H e I), foram incubadas com Fluo-4, AM, e receberam estímulo de KCl no meio extracelular, por meio de solução de Hank’s (HBSS) em diferentes concentrações: 5 mM (Painéis A, D e G), 15 mM (Painéis B, E e H) e 50 mM (Painéis C, F e I). Foi observado aumento da intensidade de fluorescência (ΔF) relacionado ao Δ[Ca2+]
i, especialmente na concentração mais alta
A análise estatística demonstrou diferença significativa (p < 0,05; ANOVA two-way seguido por pós-teste de Bonferroni) no pico de fluorescência (KCl 50 mM) entre os grupos STZ e STZ+LLLT (Figura 44, Painéis A e B). Os neurônios provenientes dos GRDs L4-L5 de ratos diabéticos neuropáticos tratados com LLLT (grupo STZ+LLLT), apresentaram menor responsividade (com base na intensidade de fluorescência, em unidades arbitrárias) ao estímulo com alta concentração de potássio (KCl 50 mM). Nos três grupos de células (SCB, STZ e STZ+LLLT), após o pico de fluorescência, a intensidade deste (calculado pelo Δ[Ca2+]i,) não retornou aos valores basais, conforme observado na Figura 44, Painel B.
Figura 44. Dinâmica de cálcio intracelular: experimento ex vivo. Painel A: Os neurônios cultivados a partir de GRDs L4-L5 de ratos diabéticos neuropáticos tratados com LLLT (grupo STZ+LLLT; linha azul), apresentaram menor intensidade de fluorescência (ΔF), calculada pelo Δ[Ca2+]i, em relação aos neurônios de
animais diabéticos neuropáticos sem tratamento (grupo STZ; linha vermelha), durante estímulo com alta concentração de KCl (50 mM). Não foram observadas diferenças na intensidade de fluorescência (ΔF) entre os grupos de neurônios durante os estímulos com KCl 5 (basal) e 15 mM. Painel B: Zoom dos picos de fluorescência durante o estímulo com alta concentração de KCl (50 mM). A análise estatística foi realizada a partir dos picos de fluorescência observados durante o estímulo com alta concentração de KCl (50 mM). Após o estímulo, a intensidade de fluorescência [ΔF = (F-F0) / F0] não retornou aos valores basais para nenhum dos grupos. Teste-t não-pareado. Símbolo (*) representa p < 0,05; n = número neurônios do GRD, por grupo. Dados expressos como a média de cada placa, para cada segundo (s).
Além da intensidade de fluorescência relacionada ao Δ[Ca2+]i, foi realizado o estudo populacional dos neurônios que responderam às diferentes concentrações de KCl (exceto 5 mM, basal). Não foram observadas diferenças significativas no número de neurônios responsivos entre os diferentes grupos (SCB, STZ e STZ+LLLT), para ambas as concentrações de KCl (15 ou 50 mM), conforme observado na Figura 45, Painéis A e B. Da
mesma maneira, a porcentagem8 de neurônios responsivos à menor concentração de KCl (15 mM) não se alterou (Figura 45, Painel C).
Figura 45. Dinâmica de cálcio intracelular (ex vivo): estudo populacional. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos SCB (barras pretas), STZ (barras vermelhas) e STZ+LLLT (barras azuis) no número de células responsivas ao estímulo com KCl 15 mM (Painel A) ou ao estímulo com KCl 50 mM (Painel B). Painel C: gráfico de barras mostrando a porcentagem (%) de células responsivas à menor concentração de KCl (15 mM) em relação ao total de neurônios responsivos (viáveis), que responderam ao estímulo com alta concentração de potássio (KCl 50 mM). Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos. ANOVA one-way seguido por pós-teste de Bonferroni. Dados expressos como média ± erro padrão da média (SEM).
5.13.2 Experimento in vitro: dinâmica de cálcio intracelular em cultura primária de neurônios do GRD mantidos em meio normoglicêmico ou hiperglicêmico e expostos à LLLT (long-term response)9
Foi realizado estudo da dinâmica de cálcio intracelular em cultura primária de neurônios do GRD, mantidos durante 24 h em meio normoglicêmico (5,5 mM de glicose) ou hiperglicêmico (55 mM de glicose) (grupos Low-glucose e High-glucose, respectivamente) e, também, de neurônios expostos à LLLT por meio da técnica de varredura (swiping motion) (grupos Low-glucose+LLLT e High-glucose+LLLT, respectivamente). Nas imagens representativas das culturas de neurônios do GRD (Figura 46), é possível observar aumento da intensidade de fluorescência durante o estímulo com 15 mM de KCl e, especialmente, durante o estímulo com alta concentração de potássio (50 mM de KCl).
8 Porcentagem (%) em relação ao número total de neurônios responsivos (viáveis), os quais assumimos serem
aqueles que respondem ao estímulo com alta concentração de potássio (KCl 50 mM).
9 Long-term response refere-se às alterações da fluorescência causadas pela exposição prévia à LLLT, ou seja, as
Figura 46. Imagens representativas da fluorescência relacionada ao Δ[Ca2+]idurante os incrementos da concentração de KCl no meio extracelular. As culturas de neurônios aferentes primários, a partir dos GRDs de ratos saudáveis (Naïve), foram mantidas em meio normoglicêmico (5,5 mM de glicose; grupo Low-glucose) (Painéis A a F) ou hiperglicêmico (55 mM de glicose; grupo High-glucose) (Painéis G a L) durante 24 h. Após este período, placas de cultura em meio normoglicêmico (Painéis D, E e F; grupo Low-glucose+LLLT) ou hiperglicêmico (Painéis J, K e L; grupo High-glucose+LLLT) foram expostas à LLLT (AsGa, 904 nm; 2,03 J; 29 s; swiping motion). Após a incubação com Fluo-4, AM, as placas de cultura receberam estímulo com KCl em diferentes concentrações: 5 mM (Painéis A, D, G e J), 15 mM (B, E, H e K) e 50 mM (C, F, I e L). Houve aumento da intensidade de fluorescência para todos os grupos de neurônios durante o estímulo com KCl 50 mM, e particularmente, para o grupo High-glucose, durante o estímulo com KCl 15 mM (Painel H). Aumento de 10x.
Na quantificação da intensidade de fluorescência (Δ[Ca2+]i), foram observadas diferenças significativas entre os grupos Low-glucose e Low-glucose+LLLT (p < 0,05; ANOVA one-way seguido por pós-teste de Bonferroni). Uma única exposição dos neurônios à LLLT (grupo Low-glucose+LLLT) foi capaz de reduzir a intensidade de fluorescência (Δ[Ca2+]i) destes, em comparação aos não-irradiados (grupo Low-glucose), durante o estímulo com alta concentração de potássio ↑[K+]e (KCl 50 mM), conforme observado nas Figuras 47 e 48. Não foram observadas diferenças entre os demais grupos durante o pico de fluorescência (KCl 50 mM), entretanto, após o pico, ambos os grupos de neurônios em meio hiperglicêmico (grupos High-glucose e High-glucose+LLLT) apresentaram intensidade de fluorescência
(Δ[Ca2+]i) maior, em comparação aos normoglicêmicos (grupos Low-glucose e Low- glucose+LLLT).
Figura 47. Dinâmica de cálcio intracelular: experimento in vitro. Os neurônios coletados a partir de GRDs de ratos Naïve, foram cultivados por 24 h em meio normoglicêmico (5,5 mM de glicose; grupo Low-glucose; linha preta) ou hiperglicêmico (55 mM de glicose; grupo High-glucose; linha vermelha) e expostos à LLLT (AsGa, 904 nm; 2,03 J; 29 s; swiping motion) (grupo Low-glucose+LLLT; linha azul; grupo High-glucose+LLLT; linha verde). Após a LLLT e o período de incubação com Fluo4, AM, os neurônios foram estimulados com diferentes concentrações de potássio ↑[K+]
e (KCl 5, 15 e 50 mM). Durante o estímulo com KCl 15 mM, o grupo High- glucose apresentou intensidade de fluorescência significativamente superior ao grupo High-glucose+LLLT (p <
0,001; linhas cinzas contínuas). Durante o maior pico de fluorescência, relativo ao estímulo com alta concentração de potássio (50 mM), não foram observadas diferenças entre os grupos com relação à concentração de glicose do meio (5,5 mM ou 55 mM de glicose). Entretanto, o grupo Low-glucose+LLLT apresentou menor intensidade de fluorescência em comparação ao grupo Low-glucose, durante o estímulo com KCl 50 mM (p < 0,05; linhas pretas pontilhadas). ANOVA one-way seguido por pós-teste de Bonferroni. Dados expressos como a média de cada placa, para cada segundo.
Figura 48. Dinâmica de cálcio intracelular: diferenças com relação à intensidade do estímulo (KCl 15 ou 50 mM). Painel A: Foi observada diferença significativa (p < 0,001) entre os grupos High-glucose (linha vermelha) e High-glucose+LLLT (linha verde), durante o estímulo com a menor concentração de potássio (KCl 15 mM). Da mesma maneira, ambos os grupos hiperglicêmicos (High-glucose e High-glucose+LLLT) apresentaram maior intensidade de fluorescência em comparação aos normoglicêmicos (Low-glucose, linha preta; Low-glucose+LLLT, linha azul). A hiperglicemia do meio (55 mM de glicose), favoreceu maior “sensibilização” dos neurônios, os quais tornaram-se mais responsivos à uma menor concentração de KCl (15 mM). Painel B: durante o maior pico de fluorescência, relativo ao estímulo com alta concentração de potássio (KCl 50 mM), não foram observadas diferenças entre os grupos com relação à concentração de glicose do meio, entretanto o grupo Low-glucose+LLLT apresentou menor intensidade de fluorescência em comparação ao Low-
glucose (p < 0,001). À direita, pico representativo de um único neurônio, durante estímulo com alta concentração
de potássio (KCl 50 mM). ANOVA one-way seguido por pós-teste de Bonferroni. Dados expressos como a média de cada placa, para cada segundo.
Além da intensidade de fluorescência relacionada ao Δ[Ca2+]i, foi realizado estudo populacional dos neurônios do GRD que responderam às diferentes concentrações de potássio (KCl 15 e 50 mM). Foi observada diferença significativa do número de neurônios responsivos no grupo High-glucose em comparação aos demais grupos (High-glucose+LLLT; Low- glucose; Low-glucose+LLLT), durante o estímulo com 15 mM de KCl (p < 0,01; ANOVA one-way seguido por pós-teste de Bonferroni) (Figura 49, Painel A). No estímulo com alta concentração de potássio (KCl 50 mM), o grupo Low-glucose apresentou o maior número de neurônios responsivos, sendo estatisticamente superior ao grupo Low-glucose+LLLT (p < 0,01; ANOVA one-way seguido por pós-teste de Bonferroni) (Figura 49, Painel B). A porcentagem de neurônios responsivos à menor concentração de potássio (KCl 15 mM), em relação ao total de neurônios responsivos ao estímulo máximo (KCl 50 mM), foi significativamente maior no grupo High-glucose em comparação aos normoglicêmicos (Low- glucose e Low-glucose+LLLT) (p < 0,001; ANOVA one-way seguido por pós-teste de Bonferroni), e em relação ao High-glucose+LLLT (p < 0,05; ANOVA one-way seguido por pós-teste de Bonferroni), como observado na Figura 49, Painel C.
Figura 49. Dinâmica de cálcio intracelular (in vitro): estudo populacional. Painel A: O número de células que responderam ao estímulo KCl a 15 mM foi significativamente maior (p < 0,01) no grupo High-glucose (barra vermelha) em relação aos demais grupos (High-glucose+LLLT, barra verde; Low-glucose, barra preta; Low-glucose+LLLT, barra azul). Painel B: para o estímulo com alta concentração de potássio (KCl 50 mM), o grupo Low-glucose apresentou maior número de células responsivas em comparação aos grupos Low-
glucose+LLLT (p < 0,01), High-glucose (p < 0,05) e High-glucose+LLLT (p < 0,05). Painel C: foi realizado
cálculo do percentual (%) de neurônios responsivos à menor concentração de KCl (15 mM), em relação ao total de neurônios viáveis, os quais tendem a responder ao estímulo com alta concentração de potássio (KCl 50 mM). Foram observadas diferenças significativas (p < 0,001) entre o grupo High-glucose e os demais grupos (Low-
glucose, p < 0,001; Low-glucose+LLLT, p < 0,001; High-glucose+LLLT, p < 0,05), de maneira que maior
número de neurônios responderam ao estímulo com menor concentração de potássio (KCl 15 mM), quando previamente mantidas em meio de cultura hiperglicêmico (55 mM de glicose). ANOVA one-way, seguido por pós-teste de Bonferroni. Símbolos (*), (**) e (***) representam p < 0,05, p < 0,01 e p < 0,001, respectivamente. Dados expressos como média ± erro padrão da média (SEM).
5.15 Efeitos da LLLT sobre o potencial de membrana mitocondrial (MMP) dos