Avaliação da separação das proteínas por eletroforese 2D

Enquanto na eletroforese 1D ocorre a separação das proteínas de acordo com a massa molecular, na eletroforese 2D acontece a separação das proteínas de acordo com o ponto isoelétrico e a massa molecular. Na figura obtida pelo gel unidimensional, observamos a presença de ―bandas‖ que representam as principais frações protéicas encontrados nas amostras de soja. Quando estas amostras são

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submetidas à eletroforese 2D observamos a separação detalhada dos vários spots protéicos que compõem cada uma das frações analisadas (Figura 7).

Figura 7 - Separação protéica de uma amostra de soja parental. No lado esquerdo observamos a separação por eletroforese bidimensional, focalização isoelétrica realizada em gradiente de pH linear de 3-10. No lado direito observamos a eletroforese unidimensional. Ambos os géis foram preparados com 12% de acrilamida e corados com Coomassie G-250.

A separação das proteínas de soja por eletroforese 2D usando um amplo gradiente de pH possibilita a visualização da maioria das proteínas presentes nas amostras, com identificação das regiões com predomínio de proteínas. As tiras de IPG são estáveis e capazes de focalizar simultaneamente proteínas ácidas e básicas em um único gel utilizando uma faixa de pH ampla (LÓPEZ, 2007).

Nos géis 2D com faixa de pH de 3-10 observou-se a presença de proteínas distribuídas em um amplo espectro de pontos isoelétricos e massas moleculares

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(Figura 7). Entretanto, houve uma concentração mais significativa de proteínas com pI entre 4-7 e massa molecular variando entre 14,4 - 97,0 kDa.

Na análise proteômica do gel obtido pela eletroforese 2D, o emprego de tiras de IPG com gradiente de pH de 3-10 apresentou resolução adequada e demonstrou reprodutibilidade nos resultados, permitindo uma análise comparativa entre as diferentes amostras de soja pesquisadas.

A utilização de tiras com gradiente de pH de 3-10 para análise de amostras de soja tem sido descrita em vários trabalhos (FUKUDA et al., 2005; HERMAN et al., 2003; MAGNI et al., 2005). Contudo, diante da necessidade de caracterização de proteínas específicas como a β-conglicinina, a glicinina e o inibidor de tripsina de Kunitz, tiras com gradiente de pH mais estreitos de 4-7 e 6-11 tem sido utilizadas (KRISHNAN et al., 2007; NATARAJAM et al., 2006; NATARAJAM et al., 2007). A utilização de diferentes faixas de pH demonstra ser um método efetivo para a separação de um grande número de proteínas de reserva mais ou menos abundantes (NATARAJAN et al., 2006).

Em nossas análises, foi também utilizada para a separação das proteínas de soja uma faixa de pH mais estreita com gradiente de pH de 4-7, para permitir melhor separação e maior resolução dos spots, devido ao predomínio de proteínas com pI entre 4 a 7, permitindo deste modo uma melhor identificação destas proteínas por MS. A comparação entre as duas diferentes faixas de pH pode ser observada na Figura 8.

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Figura 8 - Avaliação por eletroforese bidimensional da distribuição das proteínas do extrato bruto de soja em diferentes faixas de pH. Em (I) foi usado um gradiente de pH de 3-10 e em (II) gradiente de pH de 4-7. Coloração com Coomassie G-250.

A técnica adotada no momento da revelação das proteínas representa uma das etapas determinantes no número de spots detectados no gel. A técnica deve ter reprodutibilidade e alta sensibilidade, permitindo a visualização de um maior número possível de proteínas e ao mesmo tempo ser compatível com o método de identificação usado, como a espectrometria de massas (CANDIANO et al., 2004; GORG; WEISS; DUNN, 2004).

No método utilizado para coloração dos géis bidimensionais foi usado o corante Coomassie Brilliante Blue G-250, o qual é reprodutível e compatível com a identificação por MS. Segundo Candiano et al. (2004), o método apresenta uma sensibilidade que permite detectar proteínas com concentrações de até 1 ng. Testes preliminares, com detecção por prata não apresentaram bons resultados (dados não mostrados), apesar de ser mais sensível que o Coomassie G-250, não apresenta repetibilidade e as características imprescindíveis para a espectrometria de massa.

A aplicação de ferramentas de análise proteômica como a eletroforese bidimendional tem se tornado muito comum na área de pesquisa com alimentos, a técnica tem demonstrado grande potencial para o exame e detecção de mudanças na composição protéica. A eletroforese 2D tem sido extensivamente utilizada para

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análise da composição de amostras de soja transgênicas e isogênicas para determinação do perfil protéico e determinação da qualidade de sementes de soja (NATARAJAM et al., 2006).

Através deste método de separação eficiente, são obtidas informações úteis sobre ponto isoelétrico das proteínas, massa molecular, nível de expressão, abundância relativa e modificações pós-tradução, verificadas por alterações da mobilidade eletroforética da molécula protéica (PANDEY; MANN, 2000).

Nas imagens obtidas dos géis bidimensionais foi possível observar a presença de vários spots, que correspondem aos diversos grupos protéicos presentes na soja. Conforme observado por Kim et al. (2006), os géis obtidos permitem observar visualmente que não houve alteração significativa entre as principais frações protéicas das sementes isogênicas e transgênicas.

Podemos identificar nos géis as formas peptídicas correspondentes às frações de β-conglicinina e glicinina bem como diversas outras proteínas características da soja, como o inibidor de tripsina, usados como sinalizadores da eficácia da separação (Figura 9). Os spots foram identificados de acordo o peso molecular e o ponto isoelétrico. Os resultados obtidos estão em acordo com o observado por Herman et al. (2003), o qual realizou uma análise bidimensional do mapa protéico da soja e identificou vários spots expressos de forma mais abundante.

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Figura 9 - Géis bidimensionais obtidos a partir de extratos protéicos de soja. A, C e E representam amostras de soja parentais e B, D, e F amostras GM, respectivamente. Os spots marcados com retângulo representam as frações de β-conglicinina, os marcados com elipse as frações de glicinina o spot marcado com círculo representa o inibidor de tripsina, de acordo com o observado por Herman et al. (2003).

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