AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE LÍQUIDOS IÓNICOS NA ATIVIDADE DA

ENZIMA ELASTASE

Após o estabelecimento das condições do ensaio de inibição enzimática, foi avaliado o efeito de dez LIs disponíveis comercialmente na atividade Elastase. Os compostos testados apresentaram estruturas químicas variáveis e incorporaram diferentes elementos estruturais, permitindo a identificação de possíveis frações que poderiam atuar como toxicóforos (Tabela

70 6). A atividade da enzima foi estudada em meio aquoso e em soluções aquosas com quantidades crescentes de LI preparadas diariamente.

Os valores de IC50 para cada IL foram calculados como a concentração inibitória causando uma diminuição de 50% da atividade da Elastase (43). O tratamento dos dados foi realizado em Excel, e posteriormente o IC50 foi automaticamente calculado, por meio de um software “GraphPad prism8”.

Os LIs estudados, e os respetivos valores de IC50 calculados estão representados na Tabela 6, e os perfis de inibição de cada um deles encontram-se representados graficamente no Gráfico 21.

Tabela 6- Líquidos iónicos utilizados e respetivos pesos moleculares e IC50

Líquido iónico Peso molecular (g/mol) IC50 (mM)

1 1-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate [bmim]BF4 226,02 208,4

2 1-Ethyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate [emim]BF4 197,97 201,1

3 1-Butyl-3-methylimidazolium chloride [bmim]Cl 174,67 247,6

4 1-Ethyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate

[emim]Tfms 260,23 238,6

5 1-Butyl-1-methylpyrrolidinium chloride [bmpyrr]Cl 177,71 193,8

6 1-Butyl-4-methylpyridinium tetrafluoroborate [bmpy]BF4 237,05 239,0

7 Tetrabutylammonium acetate [tba] Ac 301,51 175,9

8 Tetrabutylammonium chloride [tba] Cl 277,92 233,2

9 Tetrabutylphosphonium methanesulfonate [Tbph] ms 354,53 229,9

71 1.5 2.0 2.5 3.0 0.0 0.5 1.0 1.5

Líquidos iónicos Elastase

Log C (mM) A ti v id a d e n o rm a li z a d a 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate 1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate 1-buthyl-4-methylpyridinium tetrafluoroborate 1-buthyl-3-methylimidazolium- chloride 1-ethyl-3-methylimidazolium trifluoromethanesulfonate Tetrabutylammonium chloride Tetrabutylammonium acetate Tetrabutylphosphonium methanesulfonate 1- butyl-3-methylimidazolium acetate 1-buthyl-3-methylpyrrolidinium -chloride

Gráfico 21- Dados experimentais da toxicidade de dez líquidos iónicos

Inicialmente, podemos concluir que o LI mais tóxico para a enzima Elastase é o Tetrabutylammonium acetate e o menos tóxico é o 1-Butyl-3-methylimidazolium acetate.

Os LIs oferecem uma gama diversificada de propriedades físico-químicas, dependendo dos catiões e aniões. Estas propriedades físico-químicas (tais como, polaridade, hidrofobicidade, viscosidade etc.) dos líquidos iónicos desempenham um papel importante na atividade da enzima e na sua estabilidade (44).

São vários os fatores que podem interferir com a toxicidade de um LI, como o comprimento da cadeia lateral de catiões alquilo, a presença de uma cadeia lateral funcionalizada no catião, a porção aniónica e a porção catiónica do líquido iónico (43).

O anião do LI tem impacto sobre a estabilidade e atividade da enzima através da sua capacidade de formação de ligação de hidrogénio e propriedades de nucleofilicidade, como demonstrado por vários grupos. Aquilo que se observa geralmente, é que um anião com elevada capacidade de formação de pontes de hidrogénio interage fortemente com a enzima, causando uma mudança conformacional na estrutura e afetando a atividade da mesma (44). Desta maneira, foi importante avaliar a influência dos diferentes aniões na atividade da enzima Elastase, utilizando os núcleos tetrafluoroborato (BF4), cloreto (Cl), trifluorometanosulfonato (Tfms) e acetato (Ac). Assim podemos comparar LIs com diferentes aniões e catiões para perceber quais os mais tóxicos para esta enzima e de que maneira a mesma é influenciada por eles.

Comparando os LIs [bmim] BF4 (IC50 = 208,4mM), [bmim] Cl (IC50 = 247,6mM), e [bmim]Ac (IC50 =288,6mM), podemos concluir que o anião tetrafluoroborato é o mais tóxico

72 para a enzima elastase uma vez que apresenta um valor de IC50 mais baixo. Foram observados valores mais baixos de IC50 para os LIs com o anião tetrafluoroborato como ([bmim] BF4 (IC50 = 208,4mM) e [emim] BF4 (IC50 =201,1mM) comparativamente com outros aniões. Este anião já mostrou anteriormente efeitos negativos consideráveis noutras enzimas como acilase (45) e citocromo c oxidase (46) e microorganismos (44). A natureza nucleofílica altera a conformação das enzimas pela interação com os sítios carregados positivamente em suas estruturas (47). O mesmo acontece quando comparamos os líquidos iónicos [emim] BF4 (IC50 = 201,1mM) e [emim] Tfms (IC50 = 238,6mM), onde o anião BF4 é igualmente mais tóxico.

Os LIs compostos pelos aniões [emim] TfMs (IC50 = 238,6mM) e [Tbph] Ms (IC50 = 229,9mM) e [bmim] Ac (IC50 = 288,6mM) revelaram um efeito insignificante sobre o comportamento enzimático e, portanto, concluímos que a toxicidade desses LIs está mais relacionada com o grupo catiónico (46). O baixo efeito tóxico desses aniões também foi verificado para outras enzimas e organismos: citrocromo c oxidase, carboxilesterase, catalase e V. fischeri (46). Por outro lado, o anião acetato demonstrou noutro caso uma elevada toxicidade, quando conjugado com o catião amónio [tba] Ac (IC50 = 175,9mM). Possivelmente, isto poderá ser explicado pela conjunção deste anião com o catião que provoca uma elevada toxicidade.

Os LIs estudados podem ser divididos em dois grupos: um compreende os ILs não aromáticos, baseados no piperidínio e pirrolidínio, enquanto o outro compreende os ILs aromáticos baseados no imidazólio e piridínio (48).

Relativamente ao núcleo da cabeça catiónica foi descrito por diversos autores como um dos principais elementos estruturais que contribuem para a toxicidade dos LIs.

Portanto, a influência de diferentes catiões na atividade da Elastase foi avaliada utilizando os núcleos: imidazólio (im), piridínio (pyr), pirrolidínio (pyrr), fosfónio (ph) (49). A inibição mais forte foi obtida com líquidos iónicos contendo azoto carregado positivamente (pirrolidínio [bmpyrr] Cl (IC50 = 193,8mM) e imidazólio [emim] BF4 (IC50=201,1mM); [bmim] BF4 (IC50 =208,4mM) comparativamente com outros catiões como [bmpy] BF4. (IC50 = 238,0mM) e [tba] Cl (IC50 = 233,2mM). Exceptuando o [bmim] Ac (IC50 = 288,6mM) que se trata de um catião imidazólio com influência de um anião acetato, que diminui a toxicidade do grupo imidazólio. Isto acontece somente neste caso para a enzima Elastase, uma vez que estes grupos apresentam, no geral, elevada toxicidade.

O líquido iónico com pirrolidínio [bmpyrr] Cl (IC50 = 193,8mM) como estrutura do núcleo catiónico, inibiu ligeiramente mais a enzima do que o análogo do imidazólio [bmim]Cl

73 (IC50 = 247,6mM) (50). Os grupos pirrolidínio [bmpyrr] Cl (IC50 = 193,8mM) apresentaram valores mais baixos de IC50 do que qualquer LI baseado em imidazólio aromático, desta forma os LIs que contêm grupos pirrolidínio são mais tóxicos para a enzima Elastase do que o núcleo de imidazólio (46).

Entre os catiões que incorporam um anel aromático, o grupo do núcleo imidazólio [bmim] BF4 (IC50 = 208,4mM) exibiu maior efeito tóxico que o pridínio [bmpy] BF4 (IC50 = 239,0mM). Embora não seja consensual a correlação entre esses dois grupos na literatura, uma tendência semelhante foi descrita para a enzima acetilcolinesterase (46).

O efeito do alongamento do comprimento da cadeia lateral alquilada tem sido discutido por vários autores como responsável por um aumento na ecotoxicidade (51). Este efeito foi nomeado como “efeito de cadeia lateral”, isto é, o alongamento da cadeia lateral alquilada de LI aumenta sua toxicidade (43,52). Isto não se verifica nos resultados obtidos, uma vez que se observarmos os LIs [emim] BF4 (IC50 = 201,1mM) e [bmim] BF4 (IC50 = 208,4mM), temos 2 e 4 carbonos respetivamente, e temos um efeito mais tóxico no líquido iónico com a menor cadeia lateral alquilada. Apesar das diferenças entres os IC50 serem ligeiras, isto pode ser justificado, tendo em conta que já foi descrito para outras enzimas, como a Acilase, que o efeito prejudicial da cadeia lateral alquilada não era tão notório quanto o esperado (43,45). O aumento da toxicidade de um LI com o aumento da cadeia lateral alquilada só se verifica acentuadamente a partir dos 4 carbonos, isto pode explicar os resultados obtidos (53). Uma vez que a diferença entres os IC50 é muito baixa, podemos concluir que comprimento da cadeia lateral de catiões alquilo é significativamente variável.

A influência do catião e do anião na toxicidade do LI parece ser independente, uma vez que a toxicidade é resultado da soma de ambos os impactos de catiões e aniões, não esquecendo os fatores externos.

74

4. CONCLUSÃO

O desenvolvimento de estratégias que permitam obter novos compostos químicos eficazes que acarretem vantagens na sua aplicação tem sido o foco da indústria farmacêutica. Como tal, a utilização de LIs em aplicações farmacêuticas tem sido uma área de grande interesse nos últimos anos devido às suas vantajosas características e propriedades. A seleção de catiões orgânicos e aniões orgânicos/inorgânicos biocompatíveis tem sido referida como uma possibilidade de produção de LIs atóxicos com vantagens em relação a outros solventes.

Através deste trabalho experimental foi possível avaliar a toxicidade de vários LIs na inibição da atividade da enzima Elastase.

Os resultados obtidos podem ser uma boa contribuição no que diz respeito ao impacto dos LIs em seres humanos. Uma vez que se trata de uma enzima humana, com elevada atividade em diversas doenças e encontrada desde o início da infeção, a sua inibição significa a diminuição da infeção/inflamação e/ou tratamento das doenças. Desta maneira, o objetivo é encontrar solventes, neste caso LIs, pouco tóxicos para o organismo e relativamente tóxicos para a enzima para que inibam a sua atividade.

Obtiveram-se valores de IC50 de175,9mM a 288,6 mM, sendo que o LI mais tóxico para a enzima elastase foi o tetrabutylammonium acetate e o menos tóxico foi o 1-Butyl-3- methylimidazolium acetate. No geral, observou-se para os LIs estudados, uma inibição enzimática preferencial pelo anião BF4 e contendo grupos pirrolidínio e imidazólios, sendo que o grupo pirrolidínio inibe a enzima com valores de EC50 tão baixos quanto 193,8 mM. Por outro lado, os grupos metanosulfonato e trifluorometanosulfonato e fosfónio apresentaram menor efeito negativo sobre a atividade enzimática.

Os resultados demonstraram que a estrutura dos LIs influencia sua toxicidade, ou seja, a composição do catião, das cadeias laterais de alquilo e dos aniões. Estes resultados podem ser justificados por considerações de relação estrutura-atividade.

Os diferentes tipos de LIs, dependendo da sua estrutura, influenciam de maneira diferente a estabilidade, a atividade e a estrutura das enzimas. Assim sendo, estes podem ter um papel inibitório e tóxico para as enzimas (51), como noutros casos podem ter um efeito positivo e vantajoso para as mesmas (34).

Ao longo deste estágio, executei e participei em todas as funções inerentes a este trabalho experimental, sendo que realizei tudo com dedicação, interesse e empenho.

Iniciei este trabalho experimental com uma pesquisa da literatura, com o objetivo de enquadramento teórico percebendo, desta maneira, o que já existia sobre o tema. De seguida,

75 autonomamente, desenvolvi tudo aquilo que foi proposto inerente este trabalho. A minha evolução do início do primeiro semestre até à data de hoje, foi notória, sendo que tudo o que aprendi inicialmente foi aplicado ao longo do tempo.

Todos os objetivos estabelecidos foram atingidos, e adquiri conhecimentos que contribuíram muito para a minha experiência laboratorial.

Em suma, esta foi uma experiência enriquecedora a todos os níveis. O balanço final do estágio foi muito positivo, no sentido de me elucidar sobre aquilo que gostaria de fazer no futuro.

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