AVALIAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS

4.4.1 Seleção da fase móvel

A fase móvel na cromatografia líquida em fase reversa é composta por água ultrapura e solvente orgânico polar, em que os solventes mais empregados são acetonitrila (ACN) e metanol (MeOH). Alguns testes de corridas cromatográficas foram realizados com metanol. No entanto, decidiu-se utilizar ACN em vez de MeOH pelo fato da ACN ser menos viscosa, o que facilita o bombeamento da fase móvel e possibilita o uso de vazões altas, diminuindo o tempo da corrida cromatográfica e mantendo a eficiência da coluna, que é afetada pelo alargamento do sinal (HOLLER, SKOOG e CROUCH, 2009).

A água ultrapura foi acidificada até pH = 3,0, pois os valores de pKa para os polifenóis são em torno de 9 (SNYDER, KIRKLAND e GLAJCH, 2012). A adição de um ácido fraco evita a ionização dos grupos hidroxilas das substâncias como os polifenóis. A facilidade da ionização dos grupos hidroxilas dos compostos fenólicos faz

com que apareçam caudas nos picos das substâncias correspondentes (PORGALI e

BUYUKTUNCEL, 2012) prejudicando a simetria dos mesmos e consequentemente reduzindo os valores de resolução (HOLLER, SKOOG e CROUCH, 2009).

Porgali e Buyuktuncel (2012) avaliaram o comportamento da retenção dos polifenóis na presença de ácido acético e ácido fórmico e com este último, os autores observaram que todos os picos referentes às substâncias padrão foram separados com sucesso. Portanto, adicionou-se ácido fórmico como um modificador de fase móvel para inibir a dissociação dos grupos hidroxilas dos compostos fenólicos.

4.4.2 Testes com eluição isocrática

A vazão e a composição da fase móvel foram definidas, inicialmente, a partir de um planejamento fatorial 2² com ponto central (Tabela 1).

Tabela 1. Planejamento fatorial 2² com ponto central, com a percentagem de ACN variando de 20 a 40%.

Ensaio Vazão (mL min-1) ACN (%) X1 X2

1 0,8 20 - -

2 1,2 20 + -

3 0,8 40 - +

4 1,2 40 + +

5* 1,0 30 0 0

X1 = Vazão; X2 = ACN; * = triplicata de ponto central

Primeiramente, realizaram-se cinco ensaios empregando a eluição isocrática, com a solução contendo a mistura dos 8 analitos, sem adição de amostra. O volume de injeção empregado foi de 20 µL e a temperatura da coluna foi fixada em 35 °C. Apenas os ensaios 1 e 2 foram testados também com amostra de vinho diluída 1:1, 1:5 e 1:10 (v/v), sem adição de analitos. Os ensaios 1 e 2 também foram testados com metanol, no lugar da acetonitrila, porém o tempo da corrida cromatográfica foi significativamente maior empregando o metanol, devido a maior viscosidade dele. A partir deste momento, fez-se testes usando apenas a acetonitrila como componente da fase móvel juntamente com a água ultra-pura acidificada (solução aquosa de ácido fórmico a0,1%).

4.4.3 Testes com a eluição em gradiente

Dois gradientes de eluição foram testados com o objetivo de se obter a melhor separação dos picos cromatográficos, ou seja, melhores valores de resolução (R) LANÇAS (2009) e seletividade (α) (HOLLER, SKOOG e CROUCH, 2009).

Após os testes em que se empregou a eluição isocrática, testou-se a eluição em gradiente (Figura 13), em que se aumentou o percentual de água na fase móvel para 85% (15% de acetonitrila, ACN), no início da corrida cromatográfica, com o intuito de se obter valores maiores de α e R, principalmente para os analitos que eluem primeiro. A vazão empregada foi de 1,2 mL min-1.

Figura 13. Gradiente de eluição: percentagem de ACN (15%) em função do tempo.

Nesse primeiro teste, a eluição em gradiente iniciou com 15% de ACN (92% de água) e permaneceu na mesma composição durante 4 minutos. O percentual de ACN aumentou gradativamente, de 4 a 25 min, até alcançar 40%, e permaneceu nesse mesmo percentual por 1 min. Em seguida, retornou à composição inicial (15% de ACN + 85% de água) e permaneceu nessa mesma composição por 3 min, para estabilizar a fase estacionária (coluna) para a próxima injeção.

Um novo gradiente de eluição (Figura 14) foi testado, no qual o percentual de água da fase móvel foi aumentado para 92% (8% de ACN), no início da corrida cromatográfica, para se alcançar valores de α e R aceitáveis para todos os analitos, tanto na solução da mistura dos 8 analitos, quanto na amostra de vinho diluída 1:10.

Nesse segundo teste, a eluição em gradiente iniciou com 8% de ACN (92% de água) e permaneceu nessa composição durante 3 minutos. O percentual de ACN aumentou gradativamente, de 3 a 31 min, até alcançar 40%. Em seguida, retornou à composição inicial (8% de ACN + 92% de água) e permaneceu nessa mesma composição por 4 min, para estabilizar a fase estacionária para a próxima injeção.

Testou-se também a eluição em gradiente com a amostra de vinho diluída em 1:5 e 1:10 (v/v), sem adição de analitos. Devido a essas diluições da amostra, além do volume de injeção de 20 µL empregado nas análises anteriores, mais dois volumes de injeção foram testados, de 30 e 50 uL, com objetivo de aumentar intensidade dos sinais cromatográficos. Além disso, diferentes temperaturas, 25, 35 e 45 °C foram testadas, e a vazão foi aumentada para 1,5 mL min-1, com intuito de reduzir o tempo da corrida cromatográfica. Desta forma, o gradiente da Figura 15 foi empregado nas análises posteriores.

4.4.4 Identificação dos analitos nos cromatogramas

A identificação dos compostos foi realizada por injeção individual de cada uma das soluções de referência diluídas. Assim, para cada composto o tempo de retenção foi determinado, como também a ordem de eluição.

4.4.4.1 Corridas cromatográficas realizadas

Inicialmente, foram realizadas oito corridas cromatográficas com as soluções

contendo cada analito individualmente, para ser identificado o tempo de retenção (TR), de cada analito.

A 9ª e a 10ª corridas cromatográficas foram realizadas com a injeção da solução

contendo os 8 analitos misturados, na concentração de 5 e 10 mg L-1 para se observar a

A 11ª, 12ª, 13ª corridas cromatográficas foram realizadass com a amostras de vinho diluído (1:1, 1:5 e 1:10), para se observar a separação dos analitos do vinho na amostra.

A 14ª corrida cromatográfica foi realizada com uma amostra de vinho (diluído 1:10) fortificada com as 8 soluções estoque de referência, para se confirmar o tempo de retenção dos oito analitos de interesse.