Avaliação de indicadores da prole na idade adulta

Para avaliar as repercussões da desnutrição e do treinamento físico na idade adulta, foram utilizadas 20 ratas Wistar primíparas, com idade de 60 dias e pesando 210±14 g, da colônia do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco. Os animais foram mantidos sob as mesmas condições experimentais descritas nos experimentos realizados na 2ª etapa. As fêmeas foram submetidas ao protocolo de treinamento físico com 7 semanas (4 semanas no período pré-gestacional e 3 semanas durante a gestação - Amorim et al., 2009) e foram manipuladas nutricionalmente durante a gestação e lactação. Após o nascimento, foram mantidas ninhadas com seis filhotes machos. Para as avaliações, 1–2 filhotes machos de cada ninhada foram aleatoriamente escolhidos. O número total de ratos utilizados para o experimento foi: filhotes de mães não-treinadas nutridas (NT-Nf, n=8);

filhotes de mães não-treinadas desnutridas (NT-Df, n=8); filhotes de mães treinadas nutridas

(T-Nf, n=8); e filhotes de mães treinadas desnutridas (T-Df, n=8).

Os cuidados com os animais seguiram as recomendações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco - no 008676/2007-48 (Anexo – B).

O ganho de peso materno, o número de filhotes nascidos por ninhada, o peso da ninhada, o peso corporal ao nascer de cada neonato e a taxa de crescimento da prole foram avaliados conforme descrito nos experimentos realizados na 1ª etapa.

5.3.1 Avaliação do consumo alimentar materno

O consumo alimentar (g) das ratas foi avaliado diariamente, durante a gestação e lactação, e foi obtido pela subtração do peso (Marte®, modelo S-4000) da dieta ofertada e o peso da dieta restante após 24h, de acordo com a seguinte fórmula:

Consumo alimentar = Peso da ração (g) - Peso da ração do dia anterior (g) (Lopes-de-Souza et al., 2008)

5.3.2 Determinação do Índice de Massa Corporal (IMC), Índice de Lee e Relação abdômen/tórax (RAT) da prole

O IMC e o Índice de Lee foram avaliados aos 30, 60, 90, 120 e 150 dias de idade e a RAT foi avaliado somente aos 150 dias de idade. O peso (g) e a extensão corporal (cm) (Figura 8) foram utilizados para determinar os seguintes parâmetros:

IMC = Peso corporal (g) / Extensão naso-anal2 (cm2) (Novelli et al., 2007)

Índice de Lee = Raiz cúbica do peso corporal (g) / Extensão naso-anal (cm) (Novelli et al., 2007; Bernardis et al., 1968)

A circunferência torácica (cm), linha perpendicular ao eixo longitudinal na altura da décima terceira vértebra torácica, últimas costela e região esternal, e a circunferência abdominal (cm), maior circunferência entre a borda superior da crista ilíaca e a última costela (Figura 6), foram utilizadas para obter a relação abdômen/tórax através da seguinte fórmula:

RAT = Circunferência abdominal (cm) / Circunferência torácica (cm) (Novelli et al., 2007)

Figura 8. Procedimento de avaliação das dimensões corporais de ratos aos 150 dias de idade

5.3.3 Avaliação de parâmetros bioquímicos das mães e da prole

5.3.3.1 Verificação da glicemia e do colesterol sérico das mães e da prole

Após jejum de 6 horas, os animais sofreram um corte na extremidade da cauda para coleta do sangue. A glicose e o colesterol séricos (mg.dL-1) das fêmeas foram avaliados semanalmente durante o protocolo de treinamento físico. A primeira coleta foi realizada dois dias antes do início do treinamento físico, correspondendo ao tempo 0 (t0). A última coleta foi no 20o dia de gestação. Nos filhotes, a glicemia e colesterolemia foram avaliadas aos 150 dias de idade. As concentrações de glicose sanguínea foram identificadas pelo método enzimático colorimétrico da glicose oxidase/peroxidase e a leitura através de glicosímetro (Accu Check Advantage®, Roche Diagnostics Ltd., Mannheim, Alemanha) (Figura 9).

Figura 9. Procedimento de coleta e verificação da glicemia e colesterol séricos das mães e de ratos aos 150 dias de idade

5.3.3.2 Teste de Tolerância à Glicose (GTT) e Teste de Tolerância à Insulina (ITT) da prole

Teste de tolerância à glicose (GTT)

O teste foi realizado aos 145 dias de idade. Após jejum de 12 horas, foi feita a primeira coleta de sangue (tempo 0), através de corte na extremidade da cauda do animal, para retirada de uma alíquota de 10 µL. Em seguida, foi administrada, por via intraperitonial, uma solução de glicose a 50% (Equiplex Indústria Farmacêutica Ltda., Aparecida de Goiânia, GO,

Brasil) na dose de 1mg/1g de peso do animal, e outras amostras de sangue foram coletadas nos tempos 15, 30, 45, 60 e 120 minutos. Foi calculada a área sob a curva de glicose (∆G), obtida pelos valores de glicemia nos tempos 0, 30, 60 e 120 minutos, por meio do método trapezoidal (Le Floch et al., 1990; Mathews et al., 1990).

Teste de tolerância à insulina (ITT)

Aos 147 dias de idade e 48 horas após o GTT, foi realizado o teste. Após a primeira coleta de sangue (tempo 0) foi administrada, por via intraperitonial, uma solução de insulina lispro (Humalog®, Eli Lilly do Brasil Ltda., São Paulo, SP, Brasil), na dose de 0,75mU/1g de peso do animal, e outras amostras de sangue foram coletadas nos tempos 15, 30, 45, 60 e 120 minutos. Com os valores de glicemia obtidos nos tempos 0, 30 e 60 minutos foi calculada a velocidade constante de decaimento da glicemia (Kitt), que expressa à queda da glicemia em %minuto, utilizando a seguinte fórmula:

Kitt = 0,693/t½ (Le Floch et al., 1990; Lundbaek, 1962)

5.3.4 Coleta do sangue da prole

Aos 150 dias de idade, após a avaliação da glicemia, colesterolemia e das dimensões corporais, os animais foram anestesiados com ketamina (0,25 mL/100g de pesso corporal) e xilazina (0,25 mL/100g de pesso corporal) e 5 mL de sangue foram coletados em tubos contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) através de punção cardíaca. Após a coleta, as amostras de sangue foram imediatamente centrifugadas (4.000 rpm, 10 min, 4°C). O

plasma foi armazenado em tubos eppendorf e estocado a – 80oC para posterior análise.

5.3.5 Avaliação de parâmetros metabólicos do sangue da prole

Inicialmente, o plasma foi vortexado, para descongelamento e homogenização, e 900µL foram aliquotados para análise da leptina plasmática.

Leptina

Para determinar a leptina foi utilizado kit para radioimunoensaio (RIE) (Linco Research Inc., St Charles, MO, USA). Este kit de medidas possui limite mínimo de sensibilidade de 0,5ng.mL-1 e amplitude de detecção de 0,5 a 50ng.mL-1. Todas as medidas foram realizadas em um único ensaio e o coeficiente de variação intraensaio foi de 2,9%.

Figura 10. Representação esquemática das avaliações na 3ª etapa do experimento