Avaliação de marcadores de estresse oxidativo

Após a finalização das avaliações auditivas, coletou-se o material para avaliação de marcadores de estresse oxidativo. As análises foram realizadas no laboratório de Biogenômica do Departamento de Morfologia do CCS da UFSM.

Para a análise de marcadores de estresse oxidativo foram utilizadas as células da urina, tratando-se assim, de uma coleta indolor e simples. Cada aluno foi instruído a realizar a coleta em um pequeno recipiente de plástico com capacidade para 40-50 ml, da primeira urina da manhã, desprezando o primeiro jato. Esta pequena quantidade de urina desprezada serviu para eliminar as impurezas que pudessem estar na uretra. Após a eliminação do primeiro jato, encheu-se o recipiente com o resto da urina. Os recipientes contendo amostra, foram transportados sob refrigeração ao Laboratório de Biogenômica da UFSM para as análises.

Para a análise das amostras, o conteúdo foi transferido para tubos de ensaio que foram centrifugados por 10 minutos a 2000 RPM (rotações por minuto). Obtendo-se assim, a separação das células e sobrenadante e, em seguida, foram realizados os testes abaixo descritos.

4.6.4.1 Produção de EROS – DCFH-DA

A produção de ERO foi monitorada através o uso de uma sonda fluorescente, a 2,7’ - diclorofluoresceína (DCF). Este ensaio foi baseado no seguinte pressuposto químico: o diacetato de diclorofluoresceína (DCF-DA) é capaz de se difundir através de membranas celulares. Dentro das células esta molécula é deacetilada pela ação das enzimas esterases intracelulares. Esta reação forma, por sua vez, um produto não-fluorescente, a dihidroclorofluoresceína (DCFH).

A DCFH na presença de ERO é oxidada (preferencialmente peróxidos, hidroperóxidos e NO●) passando para uma forma altamente fluorescente a diclorofluoresceína (DCF). Assim, a oxidação do DCFH pelas células causa a fluorescência da diclorofluoresceína que pode ser detectada nos comprimentos de onda 525 nm de emissão e 488 nm de excitação (ESPOSTI, 2002; BARRY et al., 2004).

O teste realizado utilizou-se de placa escura de 96 poços, cada amostra foi testada em octuplicata. Para cada teste foi pipetado 65 ul de TrisHCl (10mM) pH 7,4 em seguida 50 ul de células epiteliais e, por último, 10 ul de DCFH-DA (0,1mM), no teste controle (Branco) foram utilizados 115 ul TrisHCl (10mM) pH 7,4 e 10 ul de DCFH-DA. Incubou-se então por 1 hora no escuro e, em seguida, procedeu-se a leitura em fluorímetro (Multi-mode M2/M2e SpectraMax Leitor Plate, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, EUA).

4.6.4.2 DNA Picogreen

Quant-iT PicoGreen ® reagente dsDNA ™ é um ácido nucleico fluorescente utilizado para detecção e quantificação de DNA dupla fita (dsDNA) nas células epiteliais, indicando assim morte celular, pois para que o DNA dupla fita esteja livre nas células epiteliais, a célula precisa ter rompido suas membranas (HÁ et al., 2011). O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante (Quant ITTM, Invitrogen). O reagente Picogreen foi diluído a 1:200 com tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 7,5) e incubado com 50 μl de células epiteliais no escuro à temperatura ambiente durante 5 minutos. Para minimizar efeitos de fotobranqueamento, o tempo para a medição de fluorescência foi mantido constante para todas as amostras. Uma curva padrão foi gerada utilizando DNA dupla fita de

timo de bezerro fornecido pelo fabricante. Todas as medições de fluorescência foram registradas num fluorímetro (Multi-mode M2/M2e SpectraMax Leitor Plate, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, EUA) nos comprimento de onda de 528 nm de emissão e 485nm de excitação, à temperatura ambiente (25ºC). O ensaio foi realizado em placa 96 poços, previamente exposta a luz UV por 30 minutos extinguindo-se assim, a possibilidade de haver DNA dupla fita na placa e aumentando a confiabilidade do teste, cada amostra foi testada em octuplicata.

4.6.4.3 Análises entre resultados audiológicos e marcadores de estresse oxidativo

Realizou-se uma análise descritiva dos marcadores de estresse oxidativo, a partir de valores médios, mínimo e máximo, além do desvio padrão para os dois testes realizados. Além disso, para a análise de ERO, a partir do teste DCFH-DA, foram utilizados valores de referência baseados na distribuição dos percentis observados, a partir dos valores encontrados nas amostras, sendo distribuídas em dois grupos: até 8000 ERO e acima de 8000 ERO.

Após esta análise dos marcadores de estresse oxidativo, separadamente, foi realizada uma análise em conjunto dos resultados audiológicos para sua associação com os marcadores de estresse oxidativo.

Tal análise foi realizada da seguinte forma: as variáveis com os dados encontrados nas respostas auditivas (questionários e avaliações) foram reunidas em grupos com resultado considerado sem fatores de risco para a saúde auditiva e demais resultados considerados com presença de fatores de risco para a saúde auditiva.

Os resultados considerados sem fatores de risco para a saúde auditiva (cinco respostas consideradas positivas) foram: não apresentar histórico de dores de ouvido, não apresentar queixa de zumbido, presença de efeito de supressão na orelha direita, presença de efeito de supressão na orelha esquerda e referir menor tempo de exposição auditiva diária.

Os resultados considerados com presença de fatores de risco para a saúde auditiva (cinco respostas consideradas negativas): presença de histórico de dores de ouvido, queixa de zumbido, ausência de efeito de supressão na orelha direita, ausência de efeito de supressão na orelha esquerda e referir maior tempo de exposição auditiva diária.

Entre estes dois grupos, consideraram-se os demais, em que apresentaram entre duas e quatro respostas avaliadas de risco para a saúde auditiva.

Mostrou-se necessária esta forma de análise, por perceber-se que os resultados referentes ao status auditivo são associados e que, partindo de uma análise de marcadores de estresse oxidativo, o sistema auditivo não pode ser separado e a exposição de uma análise em conjunto seria mais válida e fidedigna.