HUMANA E CANINA.
As leishmanioses são doenças negligenciadas que acometem milhões de pessoas anualmente. A utilização de testes diagnósticos eficazes e o estudo da patogenia da doença, importante para a identificação de novos alvos terapêuticos ou vacinais, são essenciais para contribuir com o controle da doença (DAVIES et al., 2003; SRIVIDYA et al., 2012).
Neste estudo, primeiramente avaliamos novos alvos antigênicos quanto ao seu potencial diagnóstico, frente a soros humanos e caninos infectados com L. infantum. A maioria desses antígenos testados aqui eram proteínas compostas por uma série de motivos repetitivos, caracterizadas pela presença de pelo menos duas ou mais cópias de uma sequência repetida de aminoácidos. Na literatura, elas foram relatadas em vários organismos, de vírus a humanos, e geralmente apresentam alta antigenicidade. Foi sugerido que esta antigenicidade estaria relacionada provavelmente devido a estimulação da produção de anticorpos pelas células B, através da ligação direta destes antígenos repetitivos, por uma via independente das ações padrões de estimulação de linfócitos T (VOS et al., 2000; GOTO et al., 2008; GOTO et al. 2010; VALIENTE-GABIOUD et al., 2011).
Os antígenos testados apresentaram grande variação de antigenicidade entre os cães e humanos, com melhor resultado associado a detecção da doença em cães. Isso também foi encontrado no estudo de FONSECA et al. 2014, que
testou a eficiência de três antígenos em detectar a leishmaniose canina e humana e apresentou melhor resultado em cães. Nos nossos testes, vários antígenos testados mostraram ótimo potencial para o diagnóstico da forma canina da doença, com um deles (Lci13), demonstrando a capacidade de detectar a leishmaniose canina melhor do que o lisado total de parasitas. Esta proteína é um antígeno promissor, uma vez que alguns estudos não encontraram uma única proteína com sensibilidade tão alta para o diagnóstico canino (FRAGA et al., 2014; FONSECA et al., 2014). No entanto, nenhum dos antígenos testados apresentou um resultado de sensibilidade suficiente para diagnosticar satisfatoriamente a LV humana. Isso corrobora os achados de GOTO et al., 2009 e OLIVEIRA et al., 2011, que destacam as diferenças na resposta imune entre esses dois diferentes alvos da doença.
Nos ensaios descritos aqui, o antígeno comercial rK39 foi incluído para facilitar a comparação dos antígenos recentemente identificados com outros descritos anteriormente e também para avaliar o nível de resposta imune dos soros selecionados para este estudo. Os resultados da rK39 se apresentaram consistentes com o que foi relatado na literatura, confirmando que ele é eficaz para o diagnóstico de LV humana, mas não apresenta boa performance com a forma canina da doença (MAIA et al., 2012; QUINNELL et al. 2013).
Os antígenos recombinantes testados apresentaram diferenças importantes na sensibilidade quando testados em soros de humanos e de cães, como já foi visto por nós e outros usando diferentes proteínas recombinantes no mesmo tipo de ensaio (GOTO et al. 2009; OLIVEIRA et al., 2011). Essa variação pode ser devido a maneira diferenciada que os hospedeiros vertebrados reagem ao parasita, principalmente no que diz respeito ao reconhecimento e apresentação dos antígenos distintos estudados ao sistema imunológico ou, como foi proposto
(GOTO et al., 2009), essa resposta pode ser devido a diferentes mecanismos de sobrevivência parasitária em cada hospedeiro (homem e cão). Por outro lado, uma vez que foi demonstrado que as variações na sensibilidade podem ser devido a fases sintomáticas e assintomáticas da doença, com a fase sintomática demostrando o melhor desempenho de sensibilidade nos testes sorológicos (METTLER et al., 2005), essas diferenças podem, até certo ponto, refletir o estágio da doença dos indivíduos de quem os soros foram coletados. Em geral, o reconhecimento diferencial das proteínas estudadas pelos soros dos dois hospedeiros destaca as diferenças nas respostas imunes induzidas pelo parasita e a necessidade de otimizar os testes sorológicos atuais.
Como uma alternativa para melhorar o diagnóstico da LV em seres humanos, propusemos a avaliação de um "Mix" de antígenos, composto por proteínas que já produziram os melhores resultados com as amostras de cães. Eles foram escolhidos para compor o “Mix”, baseado em sua alta sensibilidade e especificidade em soros de cães, com o objetivo de combinar suas melhores características e poder criar um teste sorológico que fosse capaz de detectar a leishmaniose visceral nos dois hospedeiros. Neste “Mix”, foi adicionada a proteína Lci1, já descrita e bem avaliada previamente (OLIVEIRA et al., 2011), juntamente com as Lci12 e Lci13, avaliadas neste estudo. Como os resultados mostraram o “Mix” apresentou uma melhoria significativa para o diagnóstico em humanos, quando comparado a performance das proteínas individuais. Mas em cães, ele não se mostrou tão eficiente quando a proteína Lci13. Apesar disso, nossos resultados ainda apresentaram melhores resultados, quando comparado com outro estudo em que uma mistura semelhante de três antígenos, não levou a um aumento no desempenho do teste diagnóstico, quando comparada com as proteínas individuais
sozinhas (FONSECA et al., 2014). Essa falta de melhoria significativa em uma mistura de proteínas pode ser explicada pela diminuição da antigenicidade de cada proteína individual, devido a uma menor disposição dos peptídeos antigênicos em meio a uma mistura proteica.
Uma alternativa que poderia ser usada para lidar com as limitações apresentadas pela mistura de proteína é o desenvolvimento de proteínas quiméricas, contendo as regiões proteicas que apresentaram o melhor desempenho em avaliações sorológicas. Alguns estudos nesta área já foram realizados e mostraram uma melhora significativa na sensibilidade do teste sorológico (BOARINO et al., 2005; CAMUSSONE et al. 2009; CASTRO-JUNIOR et al., 2014).
Em resumo, os antígenos recombinantes testados individualmente neste estudo em soros humanos e de cães mostraram diferentes sensibilidades para o diagnóstico sorológico da LV, com melhor desempenho em cães. A Lci13 mostrou uma sensibilidade mais alta para o soro canino do que os testes de comerciais atuais e o lisado total de Leishmania, o que demonstra o potencial desse antígeno recombinante para detectar a leishmaniose visceral canina por conta própria. O objetivo de identificar um único antígeno ou uma combinação deles, capaz de diagnosticar ambas as formas da doença não se mostrou viável com nossas proteínas. No entanto, o desempenho observado com a mistura de proteínas testada indica que, com a melhoria, ensaios utilizando proteínas quiméricas derivadas de múltiplos antígenos podem ser uma boa opção para a obtenção de testes sorológicos com alta sensibilidade e que seriam simultaneamente eficazes para ambas as espécies.
6.2 CARACTERIZAÇÃO IN SILICO DE MÚLTIPLOS GENES CODIFICANTES DA