Avaliação do efeito anti-tumoral terapêutico de formulações

Com o objetivo de avaliar o efeito adjuvante da flagelina rFliC para ativação de células T CD8+ E7-específicas, realizamos ensaios de proteção terapêutica no qual camundongos C57BL/6 foram primeiramente desafiados com 7,5 x104 _células

TC-1 pela via subcutânea e, subsequentemente, imunizados por esta mesma via, em local próximo ao da inoculação de células TC-1. Grupos de oito camundongos receberam 4 doses de PBS, E7(20 µg), rFliC (5 µg) ou a combinação E7+rFliC administradas a intervalos de uma semana pela via subcutânea. O protocolo de imunização foi iniciado dois dias após o desafio e os animais observados quanto ao desenvolvimento de tumor subcutâneo durante 50 dias ou até que o tumor atingisse o diâmetro de 1,5 cm, momento em que foram submetidos à eutanásia. A formulação E7+rFliC, bem como os controles, não foram capazes de induzir resposta protetora contra o tumor TC-1 nos animais imunizados (Figura 16). Além disso, observou-se crescimento precoce do tumor no grupo imunizado apenas com rFliC. Estes dados mostram que mesmo após administração de 4 doses da formulação E7+rFliC, a flagelina não promoveu qualquer resposta efetora capaz de

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impedir ou retardar o crescimento do tumor nos animais imunizados terapêuticamente.

Apesar do modelo de desafio subcutâneo ser amplamente utilizado, ele fornece resultados apenas qualitativos uma vez que correlaciona a proteção com ausência de tumor e determina que animais que apresentarem tumor persistente em qualquer período sejam considerados desprotegidos. Outro modelo de desafio tumoral que pode ser utilizado para avaliação de formulações vacinais contra tumores induzidos por HPV-16 é o modelo de desafio intravenoso com células TC-1. Quando inoculadas pela via i.v., as células TC-1 migram para os pulmões onde se desenvolvem formando nódulos tumorais semelhantes a vesículas e que podem ser quantificados neste órgão, em média, 40 dias após o desafio. Além disso, este modelo de desafio nos permite observar a morfologia dos nódulos e do tecido pulmonar e inferir algumas correlações além da constatação da presença ou ausência do tumor.

Figura 16 - Ensaio de proteção terapêutica em camundongos desafiados com células TC-1 via s.c. e imunizados com 4 doses de formulações contendo a proteína E7 e flagelina como adjuvante. Camundongos C57BL/6 foram

inoculados com 7,5x104 _{células TC-1 e após dois dias, imunizados via s.c. com}

cada uma das formulações: PBS, E7, rFliC ou E7+rFliC. O desenvolvimento do tumor foi acompanhado por 50 dias ou até que atingisse 1,5 cm de tamanho, circunstância na qual os animais foram submetidos à eutanásia.

Desse modo, realizamos um novo experimento onde grupos de cinco a seis camundongos C57BL/6 foram desafiados com 1,0 x104 _{células TC-1 via intravenosa}

(através do plexo retro-orbital). Além disso, baseados em resultados prévios de Braga et al. (2009, 2010) que demonstraram o potencial da flagelina de Salmonella

Typhimurium para ativação de linfócitos T CD4+ _{e T CD8}+ _{no pulmão de animais}

imunizados pela via intranasal, modificamos a via de imunização utilizada anteriormente. Logo, dois dias após o desafio, iniciamos o protocolo de imunização com a administração das formulações descritas anteriormente pela via intranasal. Foram administradas 3 doses de cada formulação a intervalos de uma semana, em dois experimentos independentes. Com esta modificação esperávamos que a resposta local induzida pela formulação E7+rFliC fosse capaz de estimular linfócitos T CD8+ e mediar proteção contra o desenvolvimento do tumor no pulmão, mas, conforme apresentado na figura 17A, três doses desta formulação foi capaz de promover apenas discreta diminuição do número de nódulos tumorais comparada ao grupo que recebeu PBS, sem apresentar diferença estatítica com animais do grupo imunizado com E7 na ausência de adjuvante. Além disso, observamos que o grupo imunizado com rFliC apresentou número e tamanho dos nódulos tumorais maiores que aqueles encontrados nos demais grupos e que refletiram no aumento dos pesos dos pulmões destes animais como apresentado na figura 17B, embora sem apresentar diferenças estatísticas com os os demais grupos.

Figura 17 - Ensaio de proteção terapêutica em camundongos desafiados com células TC-1 pela via i.v. e imunizados com 3 doses de formulações contendo a proteína E7 e flagelina como adjuvante. (A) Número de nódulos tumorais em cada animal; (B) Peso dos pulmões retirados de cada animal. Camundongos C57BL/6 foram inoculados com 104 _{células TC-1 e após dois dias iniciado o} esquema de imunização de 3 doses de cada uma das formulações: PBS, E7, rFliC ou E7+rFliC administradas pela via i.n. a intervalos de uma semana. Um grupo adicional foi imunizado com PBS e não recebeu células TC-1(ND). Após 40 dias do desafio os animais foram submetidos à eutanásia e os pulmões removidos para análise.

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O ensaio descrito acima foi repetido, porém, o número de doses aumentado. Como podemos observar, a administração de 4 doses da formulação E7+rFliC promoveu diminuição do número de tumores encontrado nestes animais comparado aqueles imunizados com PBS ou demais controles imunizados com E7 ou rFliC (Figura 18A), embora sem apresentar diferenças estatísticamente significantes. Por outro lado, verificamos discreto aumento do número de tumores e da média de peso dos pulmões no grupo imunizado apenas com rFliC, sugerindo que a presença de flagelina sem antígeno exógeno promoveu o desenvolvimento do tumor, embora não seja possível realizar uma comparação direta entre os dois experimentos (Figura 17A x 18A) visto que existem diferenças no número de nódulos tumorais apresentados nos animais dos grupos controles, já que os ensaios foram realizados em momentos diferentes. Além disso, não verificamos diferenças estatísticamente significantes no tamanho dos tumores nos pulmões dos grupos PBS e E7+rFliC, sugerindo que a administração de uma dose adicional da formulação E7+rFliC foi capaz de aumentar a proteção anteriormente visualizada (Figura 18B). Em conjunto esses dados mostram que formulações contendo flagelina não foram capazes de promover 100% de proteção terapêutica contra o desenvolvimento de tumores TC-1, mas promoveram redução do número de nódulos tumorais quando combinado ao antígeno E7 e administrada no esquema de 4 doses.

Figura 18 - Ensaio de proteção terapêutica em camundongos desafiados com células TC-1 pela via i.v. e imunizados com 4 doses de formulações contendo a proteína E7 e flagelina como adjuvante. (A) Número de nódulos tumorais em cada animal; (B) Peso dos pulmões retirados de cada animal. Camundongos C57BL/6 foram inoculados com 104 _{células TC-1 e após dois} dias iniciado o esquema de imunização de 4 doses com cada uma das formulações: PBS, E7, rFliC ou E7+rFliC administradas a intervalos de uma semana pela via intranasal. Um grupo adicional foi imunizado com PBS e não recebeu células TC-1(ND). Após 40 dias do desafio os animais foram submetidos à eutanásia e os pulmões removidos para análise.

Os pulmões dos animais foram utilizados para dosagem de citocinas produzidas localmente (Figura 19). Para este fim, o pulmão de cada animal foi pesado e triturado em 1 mL de PBS contendo inibidores de proteases, e após centrifugação, o sobrenadante foi separado e utilizado para detecção das citocinas IFN-ɣ, IL-4, IL-10 e TNF-α por ELISA. Conforme apresentado na figura 19, a administração destas formulações promoveu algumas variações no perfil de citocinas produzidas no pulmão. Podemos observar que os animais tratados com formulações contendo flagelina (rFliC ou E7+rFliC) produziram menor quantidade de citocinas do tipo Th1 (IFN-ɣ e TNF-α) enquanto produziram os mais altos níveis da citocina reguladora IL-10, comparando a produção destas nos animais imunizados com PBS e E7. Por outro lado, a produção de IL-4, característica do padrão Th2, foi mais diversificada entre os grupos, mas animais imunizados com PBS e rFliC apresentaram maior produção que animais imunizados com E7 ou E7+rFliC. Além disso, verificamos que os grupos imunizados com PBS produziram as maiores quantidades das citocinas IL-4, IFN-ɣ e TNF-α, sugerindo que estas são primariamente estimuladas pelas células TC-1 durante o desenvolvimento tumoral, e que sua presença não compromete o desenvolvimento do tumor, mas a prevalência de uma delas, como a IL-10, pode deslocar o equilíbrio favorecendo o crescimento do tumor, como observamos no grupo imunizado com rFliC que apresentou maior número de nódulos tumorais (Figura 18A) e IL-10 (Figura 19C). Observamos ainda que os grupos que apresentaram a menor produção de IL-4 (E7 e E7+rFliC) (p<0,05) foram aqueles com menor número de nódulos tumorais, sugerindo que essa citocina tem importante papel no desenvolvimento do tumor. Em conjunto, estes dados sugerem que a predominância de citocinas do tipo Th1 (IFN-ɣ e TNF-α) pode ser suficiente para controlar o desenvolvimento do tumor conforme verificamos no grupo imunizado com a proteína E7 sem adjuvante (Figura 19A e 19C) e, além disso, que a presença de flagelina na formulação tendencia a produção de citocinas para o padrão do tipo Th2 que favorece o desenvolvimento do tumor, mas a combinação E7+rFliC, promove uma resposta Th2/Th1 mais balanceada e oferece resistência ao desenvolvimento do tumor (Figura 19E).

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Figura 19 - Detecção de citocinas nos pulmões de camundongos desafiados com células TC-1 pela via i.v. e imunizados com 4 doses de formulações contendo a proteína E7 e flagelina como adjuvante. Camundongos

C57BL/6 foram inoculados com 104 _{células TC-1 e após dois dias iniciado o}

esquema de imunização de 4 doses com cada uma das formulações: PBS, E7, rFliC ou E7+rFliC administradas a intervalos de uma semana pela via intranasal. Um grupo adicional foi imunizado com PBS e não recebeu células TC-1(ND), e os valores de citocinas detectadas neste grupo foram descontados dos demais grupos. Após 40 dias do desafio os animais foram submetidos à eutanásia e os pulmões removidos para análise das citocinas (A) IFN-ɣ; (B) IL-4; (C) IL-10; (D) TNF-α; e (E) determinação do padrão de

citocinas resultante Th2/Th1. Os símbolos indicam diferenças

4.1.2.1.3 Avaliação das respostas imunológicas induzidas por formulações vacinais