A análise do efeito da concentração do glicerol (4 ou 6%) no sêmen foi realizada em quatro tempos: 1. logo após a adição do glicerol, quando o sêmen já havia sido resfriado, 2. 10 minutos após a descongelação, 3. 40 minutos após a descongelação e 4. 80 minutos após a descongelação. Os resultados podem ser verificados nas tabelas 5 a 8. No sêmen resfriado, o diluidor com 4% de glicerol obteve melhor desempenho na variável atividade citoquímica mitocondrial classe I e classe IV, quando comparado com o diluidor com 6% de glicerol. Não houve diferença significativa entre as concentrações de glicerol nas análises realizadas aos 10 minutos após a descongelação. Já aos 40 minutos após a descongelação, a concentração de 4% de glicerol obteve melhor desempenho nas variáveis motilidade total, integridade de membrana plasmática e total de células com morfologia anormal. Aos 80 minutos após a descongelação, o diluidor com 4% de glicerol obteve melhor desempenho na variável integridade de acrossomo.
Tabela 5 – Valores (média ± erro padrão), das características seminais de C. jacchus no sêmen resfriado
Glicerol 4% Glicerol 6% P
Motilidade total 29,72±4,09 27,22±3,84 0,6588
Motilidade progressiva 20,83±3,53 19,72±3,37 0,8212 Integridade de membrana plasmática 54,16±4,62 48,22±5,03 0,3903 Integridade de acrossomo 63,50±2,94 60,55±2,75 0,4694
ACM classe I 39,94±3,22 25,22±4,16 0,0085
ACM classe II 30,50±3,71 25,83±4,70 0,4414
ACM classe III 3,22±0,40 4,38±0,73 0,1741
ACM classe IV 26,33±2,79 44,55±7,12 0,0262
Total defeitos maiores 34,50±1,71 33,38±2,04 0,6792 Total defeitos menores 34,11±1,90 35,83±1,88 0,5241 Total células anormais 68,61±1,83 69,22±2,10 0,8273
ACM = atividade citoquímica mitocondrial
Tabela 6 – Valores (média ± erro padrão), das características seminais de C. jacchus no sêmen 10 minutos após a descongelação
Glicerol 4% Glicerol 6% P
Motilidade total 3,11±0,58 2±0,40 0,1215
Motilidade progressiva 2,61±0,57 1,38±0,31 0,0724 Integridade de membrana plasmática 20,83±2,40 14,88±2,08 0,0706 Integridade de acrossomo 18,11±1,50 14,77±1,60 0,1371
ACM classe I 8,72±1,0 8,11±1,64 0,7521
ACM classe II 46,83±2,88 44,16±3,61 0,5679
ACM classe III 5,33±0,60 6,16±0,80 0,4109
ACM classe IV 39,11±2,98 41,55±4,50 0,6537
IFDNA 0,65±0,07 0,85±0,13 0,1849
Total defeitos maiores 39,05±1,66 37,44±2,03 0,5430 Total defeitos menores 32,16±1,50 32,33±1,76 0,9430 Total células anormais 71,22±1,80 69,77±1,03 0,4917
Tabela 7 – Valores (média ± erro padrão), das características seminais de C. jacchus no sêmen 40 minutos após a descongelação
Glicerol 4% Glicerol 6% P
Motilidade total 1.83±0.41 0.72±0.21 0,0246
Motilidade progressiva 1.33±0.32 0.61±0.18 0,0625 Integridade de membrana plasmática 19.33±2.24 15.50±1.91 0,2025 Integridade de acrossomo 13.55±1.29 12.11±1.26 0,4285
ACM classe I 8.22±1.02 5.38±0.96 0,0508
ACM classe II 43.88±2.80 42.22±3.86 0,7290
ACM classe III 5.50±0.70 5.83±0.66 0,7328
ACM classe IV 42.38±2.84 46.55±4.64 0,4496
Total defeitos maiores 36.05±1.56 38.55±1.76 0,2954 Total defeitos menores 28.05±2.52 32.55±1.53 0,1383 Total células anormais 65.94±1.58 71.11±1.49 0,0230
ACM = atividade citoquímica mitocondrial
Tabela 8 – Valores (média ± erro padrão), das características seminais de C. jacchus no sêmen 80 minutos após a descongelação
Glicerol 4% Glicerol 6% P
Motilidade total 0,77±0,29 0,22±0,10 0,0815
Motilidade progressiva 0,72±0,27 0,22±0,10 0,1052 Integridade de membrana plasmática 20,33±2,27 15,05±1,80 0,0779 Integridade de acrossomo 12,83±0,94 9,50±0,99 0,0200
ACM classe I 7,50±0,95 6,00±0,91 0,2608
ACM classe II 42,72±2,39 41,44±4,19 0,7929
ACM classe III 6,88±0,62 6,05±0,49 0,2986
ACM classe IV 42,88±2,36 46,50±4,84 0,5089
Total defeitos maiores 35,58±1,81 40,83±1,90 0,0537 Total defeitos menores 32,12±0,87 30,05±1,36 0,2171 Total células anormais 67,70±1,94 70,88±1,90 0,2502
Também foram realizadas comparações das características seminais em cada concentração de glicerol entre os quatro tempos. A tabela 9 mostra os resultados no diluidor com glicerol a 4% e a tabela 10 mostra os resultados no diluidor com glicerol a 6%. Em ambas as concentrações, as motilidades total e progressiva diminuíram significativamente do sêmen fresco ao sêmen resfriado (queda de 41,85% na motilidade total em glicerol a 4% e de 46,74% em glicerol a 6%), assim como do sêmen resfriado ao sêmen descongelado aos 10 minutos, e se mantiveram dos 10 aos 80 minutos pós descongelação. A integridade de membrana plasmática nas duas concentrações manteve-se do sêmen fresco ao sêmen resfriado, diminuiu significativamente do sêmen resfriado ao sêmen descongelado aos 10 minutos e manteve-se dos 10 aos 80 minutos pós descongelação. Na concentração de glicerol a 4%, a integridade de acrossomo manteve-se do sêmen fresco ao resfriado, e diminuiu significativamente dos 10 aos 80 minutos pós descongelação; em glicerol a 6%, a mesma variável diminuiu significativamente do sêmen fresco ao resfriado, assim como do sêmen resfriado ao descongelado aos 10 minutos, mantendo-se assim até aos 80 minutos pós-descongelação. A classe I da atividade citoquímica mitocondrial em glicerol a 4% manteve-se do sêmen fresco ao sêmen resfriado, e diminuiu significativamente do sêmen resfriado ao descongelado aos 10 minutos, mantendo-se assim até aos 80 minutos pós-descongelação. Em glicerol a 6%, a mesma variável diminuiu significativamente do sêmen fresco ao resfriado, assim como do sêmen resfriado ao descongelado aos 10 minutos, mantendo-se assim até aos 80 minutos pós descongelação. Em ambas as concentrações, o índice de fragmentação de DNA diminuiu significativamente do sêmen fresco ao descongelado. O número de espermatozoides morfologicamente anormais manteve-se o mesmo em todos os tempos nas duas concentrações de glicerol.
Tabela 9 – Resultados (média ± erro padrão) do teste de comparação de médias (LSD) das características seminais de C. jacchus no diluidor com glicerol a 4%, nos diferentes tempos
Tempo
Fresco Resfr. Desc.10 min Desc. 40 min Desc.80 min Motilidade total 51,11±4,19 a 29,72±4,10 b 3,11±0,58c 1,83±0,41c 0,77±0,29c Motilidade progressiva 35,00±4,80 a 20,83±3,53b 2,61±0,57c 1,33±0,32c 0,72±0,27c Integridade de m. plasmática 48,55±2,84 a 54,16±4,62a 20,83±2,41b 19,33±2,25b 20,33±2,27b Integridade de acrossomo 66,55±2,81 a 63,50±2,94a 18,11±1,50b 13,55±1,29b,c 12,83±0,94c ACM classe I 44,66±4,16 a 39,94±3,22a 8,72±1,0b 8,22±1.02b 7,50±0,95b ACM classe II 29,22±3,32 a 30,50±3,71a 46,83±2,88b 43,88±2,80b 42,72±2,39b ACM classe III 4,00±0,73 a,b 3,22±0,40b 5,33±0,60b,c 5,50±0,70b,c 6,88±0,62c ACM classe IV 22,11±4,76 a 26,33±2,79a 39,11±2,97b 42,38±2,84b 42,88±2,36b IFDNA 9,55±2,06 a - 0,65±0,07 b - - Total defeitos maiores 32,33±1,59 a 34,50±1,71a,b 39,05±1,66b 36,05±1,56a,b 35,58±1,81a,b Total defeitos menores 35,72±2,37 a 34,11±1,90a 32,16±1,50a,b 28.05±2,52b 32,12±0,87a,b Total células anormais 68,05±2,50 a 68,61±1,83a 71,22±1,80a 65,94±1,58a 67,70±1,94a Resfr. = sêmen resfriado; Desc. 10 min = 10 minutos após a descongelação; Desc. 40 min = 40 minutos após a descongelação; Desc. 80 min = 80 minutos após a descongelação; Integridade de m. Plasmática = integridade de membrana plasmática; ACM = atividade citoquímica mitocondrial; IFDNA = índice de fragmentação de DNA
Tabela 10 – Resultados (média ± erro padrão) do teste de comparação de médias (LSD) das características seminais de C. jacchus no diluidor com glicerol a 6%, nos diferentes tempos
Tempo
Fresco Resfr. Desc.10 min Desc. 40 min Desc.80 min Motilidade total 51,11±4,19 a 27,22±3,84b 2,00±0,40c 0,72±0,21c 0,22±0,10c Motilidade progressiva 35,00±4,80 a 19,72±3,37b 1,38±0,31c 0,61±0,18c 0,22±0,10c Integridade de m. plasmática 48,55±2,84 a 48,22±5,03a 14,88±2,08b 15,50±1,91b 15,05±1,80b Integridade de acrossomo 66,55±2,81 a 60,55±2,75b 14,77±1,59c 12,11±1,26c 9,50±0,99c ACM classe I 44,66±4,16 a 25,22±4,16b 8,11±1,64c 5,38±0,96c 6,00±0,91c ACM classe II 29,22±3,32 a 25,83±4,70a 44,16±3,61b 42,22±3,86b 41,44±4,18b ACM classe III 4,00±0,73 a,b 4,38±0,73a,b 6,16±0,80b 5,83±0,66a,b 6,05±0,48b ACM classe IV 22,11±4,76 a 44,55±7,12b 41,55±4,51b 46,55±4,64b 46,50±4,84b IFDNA 9,55±2,06 a - 0,85±0,13 b - - Total defeitos maiores 32,33±1,59 a 33,38±2,04a,b 37,44±2,03a,b,c 38,55±1,76b,c 40,83±1,89c Total defeitos menores 35,72±2,37 a 35,83±1,88a 32,33±1,76a,b 32,55±1,54a,b 30,05±1,36b Total células anormais 68,05±2,50 a 69,22±2,09a 69,77±1,03a 71,11±1,49a 70,88±1,90a Resfr. = sêmen resfriado; Desc. 10 min = 10 minutos após a descongelação; Desc. 40 min = 40 minutos após a descongelação; Desc. 80 min = 80 minutos após a descongelação; Integridade de m. Plasmática = integridade de membrana plasmática; ACM = atividade citoquímica mitocondrial; IFDNA = índice de fragmentação de DNA
Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística significante (p<0,05) pelo teste LSD
5.4 AVALIAÇÃO DO EFEITO DA CRIOPRESERVAÇÃO NAS CARACTERÍSTICAS SEMINAIS DE CALLITHRIX PENICILLATA
A análise do efeito da concentração do glicerol (4 ou 6%) no sêmen foi realizada como descrito para C. jacchus. Os resultados podem ser verificados nas tabelas 11 a 14. No sêmen resfriado e aos 40 minutos após a descongelação, não houve diferença significativa entre as concentrações de glicerol nas análises realizadas. Aos 10 minutos após a descongelação, a concentração de 4% de glicerol obteve melhor desempenho na variável motilidade progressiva e a concentração de 6% de glicerol obteve melhor desempenho no total de espermatozoides com células morfologicamente anormais. As variáveis motilidade total e motilidade progressiva apresentaram maiores valores na concentração de glicerol a 4% aos 80 minutos após a descongelação.
Tabela 11 – Valores (média ± erro padrão), das características seminais de C. penicillata no sêmen resfriado
Glicerol 4% Glicerol 6% P
Motilidade total 24,16±7,12 20,83±5,23 0,7138
Motilidade progressiva 18,33±5,72 15,00±3,87 0,6400 Integridade de membrana plasmática 44,66±6,68 39,33±5,48 0,5508 Integridade de acrossomo 71,16±4,20 69,83±5,65 0,8535
ACM classe I 17,33±3,89 22,33±2,23 0,2907
ACM classe II 48,00±5,10 47,00±5,89 0,9004
ACM classe III 5,33±1,26 5,00±0,93 0,8355
ACM classe IV 29,33±7,33 25,66±6,16 0,7097
Total defeitos maiores 32,66±4,00 33,16±1,58 0,9099 Total defeitos menores 35,33±3,70 32,50±3,21 0,5760 Total células anormais 68,00±4,99 65,66±3,53 0,7107
ACM = atividade citoquímica mitocondrial
Tabela 12 – Valores (média ± erro padrão), das características seminais de C. penicillata no sêmen 10 minutos após a descongelação
Glicerol 4% Glicerol 6% P
Motilidade total 2,83±0,87 0,83±0,31 0,0722
Motilidade progressiva 1,83±0,54 0,50±0,22 0,0464
Integridade de membrana plasmática 21,50±4,40 17,16±6,33 0,5866 Integridade de acrossomo 17,16±3,58 13,83±2,84 0,4829
ACM classe I 10,66±1,58 7,83±1,74 0,2564
ACM classe II 60,16±6,70 59,66±7,20 0,9604
ACM classe III 5,00±1,50 8,83±3,03 0,2833
ACM classe IV 24,16±6,86 23,66±7,33 0,9612
IFDNA 1,03±0,41 0,56±0,09 0,3193
Total defeitos maiores 34,33±2,26 31,33±0,84 0,2576 Total defeitos menores 35,16±1,80 29,00±2,35 0,0638 Total células anormais 69,50±2,60 60,33±2,82 0,0379
Tabela 13 – Valores (média ± erro padrão), das características seminais de C. penicillata no sêmen 40 minutos após a descongelação
Glicerol 4% Glicerol 6% P
Motilidade total 2,33±0,95 0,16±0,16 0,0725
Motilidade progressiva 1,33±0,61 0,16±0,16 0,1190 Integridade de membrana plasmática 21,50±5,17 15,66±5,85 0,4720 Integridade de acrossomo 13,33±2,64 11,50±2,17 0,6036
ACM classe I 8,16±1,22 6,83±0,40 0,3396
ACM classe II 57,33±7,12 58,16±7,51 0,9374
ACM classe III 7,33±1,20 10,33±3,12 0,3902
ACM classe IV 27,16±7,23 24,66±6,06 0,7965
Total defeitos maiores 32,50±2,60 34,50±2,95 0,6217 Total defeitos menores 30,50±1,99 27,50±1,54 0,2619 Total células anormais 63,00±3,41 62,00±3,61 0,8447
ACM = atividade citoquímica mitocondrial
Tabela 14 – Valores (média ± erro padrão), das características seminais de C. penicillata no sêmen 80 minutos após a descongelação
Glicerol 4% Glicerol 6% P
Motilidade total 0,83±0,31 0 0,0422
Motilidade progressiva 0,66±0,21 0 0,0250
Integridade de membrana plasmática 19,16±6,13 18,33±6,36 0,9267 Integridade de acrossomo 13,16±3,47 11,66±2,75 0,7422
ACM classe I 7,50±1,26 5,33±1,36 0,2690
ACM classe II 58,16±6,68 50,33±8,07 0,4721
ACM classe III 10,00±1,15 11,33±2,43 0,6310
ACM classe IV 24,33±7,00 33,00±8,47 0,4490
Total defeitos maiores 33,50±1,38 31,66±0,95 0,3012 Total defeitos menores 30,00±1,57 32,50±1,06 0,2160 Total células anormais 63,50±1,28 64,16±1,30 0,7230
Como para C. jacchus, foram realizadas comparações das características seminais em cada concentração de glicerol entre os quatro tempos. A tabela 15 mostra os resultados no diluidor com glicerol a 4% e a tabela 16 mostra os resultados no diluidor com glicerol a 6%. Nas duas concentrações, as motilidades total e progressiva diminuíram significativamente do sêmen fresco ao sêmen resfriado (queda de 57,36% na motilidade total em glicerol a 4% e de 63,24% em glicerol a 6%), assim como do sêmen resfriado ao sêmen descongelado aos 10 minutos, e se mantiveram dos 10 aos 80 minutos pós-descongelação. A integridade de membrana plasmática nas duas concentrações diminuiu significativamente do sêmen fresco ao sêmen resfriado, assim como do sêmen resfriado ao sêmen descongelado aos 10 minutos e manteve-se dos 10 aos 80 minutos pós- descongelação. A integridade de acrossomo manteve-se do sêmen fresco ao resfriado, diminuiu significativamente do sêmen resfriado ao descongelado aos 10 minutos, mantendo-se assim até aos 80 minutos pós-descongelação nas duas concentrações de glicerol. A classe I da atividade citoquímica mitocondrial em glicerol a 4% diminuiu significativamente do sêmen fresco ao sêmen resfriado, e diminuiu significativamente dos 10 aos 80 minutos após a descongelação; a mesma variável em glicerol a 6% manteve-se do sêmen fresco ao sêmen resfriado, e diminuiu significativamente do sêmen resfriado ao descongelado aos 10 minutos, mantendo-se assim até aos 80 minutos pós-descongelação. Em ambas as concentrações, o índice de fragmentação de DNA manteve-se o mesmo do sêmen fresco ao descongelado. O número de espermatozoides morfologicamente anormais manteve-se o mesmo em todos os tempos em glicerol a 4%. Já em glicerol a 6%, os espermatozoides anormais diminuíram significativamente do sêmen fresco ao sêmen descongelado aos 40 minutos.
Tabela 15 – Resultados (média ± erro padrão) do teste de comparação de médias (LSD) das características seminais de C. penicillata no diluidor com glicerol a 4%, nos diferentes tempos
Tempo
Fresco Resfr. Desc.10 min Desc. 40 min Desc.80 min Motilidade total 56,66±2,11a 24,16±7,12b 2,83±0,87c 2,33±0,95c 0,83±0,31c Motilidade progressiva 41,66±1,66 a 18,33±5,72b 1,83±0,54c 1,33±0,61c 0,66±0,21c Integridade de m. plasmática 62,83±6,90a 44,66±6,68b 21,50±4,40c 21,50±5,17c 19,16±6,13c Integridade de acrossomo 76,66±5,10a 71,16±4,20a 17,16±3,58b 13,3±2,64b 13,16±3,47b ACM classe I 29,16±5,80a 17,33±3,89b 10,66±1,58b,c 8,16±1,22b,c 7,50±1,26c ACM classe II 43,83±5,48a 48,00±5,10a 60,16±6,70a 57,33±7,12a 58,16±6,68a ACM classe III 3,00±1,60a 5,33±1,26a,b 5,00±1,50a,b 7,33±1,20a,b 10,00±1,15b ACM classe IV 24,00±8,35a 29,33±7,33a 24,16±6.86a 27,16±7,23a 24,33±7,01a IFDNA 0,37±0,23a - 1,03±0,41a - - Total defeitos maiores 29,83±2,61a 32,66±4,00a 34,33±2,26a 32,50±2,60a 33,50±1,38a Total defeitos menores 40,00±2,61a 35,33±3,70a.b 35,16±1,80a.b 30,50±1,99b 30,00±1,57b Total células anormais 69,83±2,84a 68,00±4,99a 69,50±2,60a 63,00±3,41a 63,50±1,28a Resfr. = sêmen resfriado; Desc. 10 min = 10 minutos após a descongelação; Desc. 40 min = 40 minutos após a descongelação; Desc. 80 min = 80 minutos após a descongelação; Integridade de m. Plasmática = integridade de membrana plasmática; ACM = atividade citoquímica mitocondrial; IFDNA = índice de fragmentação de DNA
Tabela 16 – Resultados (média ± erro padrão) do teste de comparação de médias (LSD) das características seminais de C. penicillata no diluidor com glicerol a 6%, nos diferentes tempos
Tempo
Fresco Resfr. Desc.10 min Desc. 40 min Desc.80 min Motilidade total 56,66±2,11a 20,83±5,23b 0,83±0,31c 0,16±0,16c 0c Motilidade progressiva 41,66±1,66 a 15,00±3,87b 0,50±0,22c 0,16±0,16c 0c Integridade de m. plasmática 62,83±6,90a 39,33±5,48b 17,16±6,33c 15,66±5,85c 18,33±6,36c Integridade de acrossomo 76,66±5,10a 69,83±5,65a 13,83±2,84b 11,50±2,17b 11,66±2,75b ACM classe I 29,16±5,80a 22,33±2,23a 7,83±1,74b 6,83±0,40b 5,33±1,36b ACM classe II 43,83±5,48a 47,00±5,88a 59,66±7,20a 58,16±7,51a 50,33±8,07a ACM classe III 3,00±1,60a 5,00±0,93a,b 8,83±3,03a,b 10,33±3,12b 11,33±2,43b ACM classe IV 24,00±8,35a 25,66±6,16a 23,66±7,33a 24,66±6,06a 33,00±8,48a IFDNA 0,37±0,23a - 0,56±0,09a - - Total defeitos maiores 29,83±2,61a 33,16±1,58a 31,33±0,84a 34,50±2,95a 31,66±0,95a Total defeitos menores 40,00±2,61a 32,50±3,21b 29,00±2,35b 27,50±1,54b 32,50±1,06b Total células anormais 69,83±2,84a 65,66±3,53a,b 60,33±2,82b 62,00±3,61a,b 64,16±1,30a,b Resfr. = sêmen resfriado; Desc. 10 min = 10 minutos após a descongelação; Desc. 40 min = 40 minutos após a descongelação; Desc. 80 min = 80 minutos após a descongelação; Integridade de m. Plasmática = integridade de membrana plasmática; ACM = atividade citoquímica mitocondrial; IFDNA = índice de fragmentação de DNA
6 DISCUSSÃO