AVALIAÇÃO DO EFEITO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE

E. benthamii E DOS TERPENOS α-PINENO, γ-TERPINENO e TERPINEN-4-OL

SOBRE CÉLULAS TUMORAIS

As linhagens celulares B16F10, HeLa, Jurkat e J774A.1 foram cultivadas rotineiramente em garrafas de 25 ou 75 cm2 com meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 24 mmol.L-1 de bicarbonato de sódio e antibiótico (penicilina 10000 UI e estreptomicina 10 mg.mL-1). As garrafas foram mantidas a 37ºC em estufa com atmosfera úmida e 5% de CO2. As células J774A.1 e Jurkat foram cedidas pela Profa. Dra Carla Cristine Kanunfre e as linhagens celulares B16F10 e HeLa foram cedidas pelo Prof. Dr. Michel Fleith Otuki e pela Profa. Dra. Katia Sabrina Paludo da Universidade Estadual de Ponta Grossa.

Além do óleo essencial das folhas de E. benthamii, foram testados os compostos α-pineno, terpinen-4-ol e γ-terpineno. Imediatamente antes de cada experimento uma solução a 100 mg.mL-1 de cada amostra foi obtida a partir da dissolução em um veículo contendo 75% de álcool etílico absoluto e 25% de propilenoglicol (VIRADOR et al., 1999). A partir dessa solução a 100 mg.mL-1, as amostras foram diluídas nas concentrações finais utilizando meio de cultivo RPMI 1640. A concentração final do veículo em cultura não ultrapassou 0,3%. Em todos os experimentos foi utilizado como controle negativo o meio RPMI 1640 contendo a mesma concentração do veículo utilizado para diluir as amostras.

4.6.1 Cultura de células Jurkat – Modelo de linfócitos T de origem leucêmica

Este tipo celular é derivado do tecido hematopoiético da gordura marrom de uma paciente com leucemia e uma de suas características é a produção de IL-2 e interferon γ (GILLIS; WATSON, 1980). Os ensaios realizados para determinação da citotoxicidade do óleo essencial das folhas adultas e jovens de E. benthamii e dos compostos isolados com a linhagem celular Jurkat estão descritos a seguir.

4.6.1.1 Ensaio de viabilidade celular pelo método de redução do MTT

As células, em meio RPMI 1640 contendo 10% de SFB, foram semeadas em placas de 24 poços (0,25 x 105 células/poço) e mantidas sob condições de cultura (37ºC em estufa com atmosfera úmida e 5% de CO2) por 24 h. Posteriormente, foram adicionadas diferentes concentrações dos óleos essenciais e dos terpenos (3, 10, 30, 100 e 300 µg.mL-1). Essas concentrações foram obtidas a partir da diluição das amostras em meio de cultivo RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB. As células foram incubadas por 24, 48 e 72 h consecutivas a 37ºC em estufa com atmosfera úmida e 5% de CO2. Após o período de incubação, o conteúdo de cada poço foi centrigufado, o sobrenadante foi desprezado e às células foi adicionado uma solução de MTT a 0,5 mg.mL-1. Em seguida, as culturas foram incubadas a 37ºC durante 30 min e ao abrigo da luz. Para a solubilização dos cristais de formazan, produto da redução do MTT, o dimetilssulfóxido (DMSO) foi adicionado e a leitura espectrofotométrica da absorbância, em comprimento de onda de 550 nm, foi realizada em leitor de placas (Biotek, µQuant). Meio RPMI 1640 e vincristina a 40 nmol.L-1 ou 36,92 ng.mL-1 foram empregados como controles negativo e positivo, respectivamente. A viabilidade celular foi determinada pela comparação dos valores de absorbância obtidos para células tratadas e não tratadas. A citotoxicidade foi expressa como a concentração da amostra que induziu morte celular em 50% das células (IC50) e foi calculada por regressão de Probit.

4.6.1.2 Ensaio de viabilidade celular pela técnica de exclusão do azul de Tripan

Este método avalia a integridade da membrana celular (MERCHANT, KAHN e MURPHY, 1964). As células, em meio RPMI 1640 contendo 10% de SFB, foram semeadas em placas de 24 poços (0,25 x 105 células/poço) e mantidas sob condições de cultura por 24 h. Posteriormente, foram adicionadas diferentes concentrações dos óleos essenciais e dos terpenos (3, 10, 30, 100 e 300 µg.mL-1). Essas concentrações foram obtidas a partir da diluição das amostras em meio de cultivo RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB. As células foram incubadas por 24, 48 e 72 h consecutivas a 37ºC em estufa com atmosfera úmida e 5% de CO2. Após esses períodos de incubação, uma alíquota de 20 µL da suspensão de células,

devidamente homogeneizada, foi retirada e diluída em azul de Tripan (0,4% em PBS). As células foram observadas e contadas em câmara de Neubauer sob microscopia óptica. O azul de Tripan penetra no interior de células que perderam a integridade da membrana. As células consideradas viáveis apresentaram-se íntegras, redondas e incolores, ao passo que, as células não-viáveis apresentaram- se coradas em azul.

4.6.1.3 Ensaio de viabilidade celular avaliado pela liberação de lactato desidrogenase (LDH)

A fim de quantificar a enzima lactato desidrogenase (LDH), liberada no citosol, após a perda da integridade da membrana, as células Jurkat (1 x 106 células), em meio RPMI 1640 contendo 10% de SFB, foram semeadas em tubos tipo Eppendorf e tratadas por 4 h com as amostras na concentração de 300 µg.mL-1 (diluídas em meio RPMI 1640 livre de SFB) a 37ºC e 5% de CO2. A determinação da atividade da LDH, que é proporcional ao número de células lisadas por processo necrótico, foi mensurada pelo emprego do kit LDH UV-PP (Analisa). Como controle positivo foi utilizado 0,1% de Triton X-100 (Sigma®) para lise celular total. Meio RPMI 1640 sem SFB foi empregado como controle negativo. Os valores de absorbância foram aferidos em espectrofotômetro com comprimento de onda de 340 nm.

4.6.1.4 Análise da fragmentação do DNA por citometria de fluxo

Para analisar se houve fragmentação do DNA provocada pelas amostras, foi realizado o protocolo descrito por Nicoletti e colaboradores (1997). As células, em meio RPMI 1640 contendo 10% de SFB, foram semeadas em placas de 24 poços (5 x 105 células/poço) e mantidas sob condições de cultura por 24 h. Posteriormente, foram adicionadas diferentes concentrações do óleo essencial das folhas adultas e jovens e do terpeno terpinen-4-ol (50, 100 e 200 µg.mL-1). Essas concentrações foram obtidas a partir da diluição das amostras em meio de cultivo RPMI 1640 suplementado com 10% de SFB. Após mais 24 h de cultura (tempo do tratamento), o conteúdo de cada poço foi centrigufado, o sobrenadante foi desprezado e o pellet

celular foi lavado com PBS gelado. Na sequência, foi retirado o sobrenadante e sobre o pellet celular foram adicionados 200 μL de tampão de lise (0,1% de citrato de sódio, 0,1% de Triton X-100® e 50 µg.mL-1 de iodeto de propídio em PBS). Os tubos foram cobertos com papel alumínio e incubados por 24 h a 4°C. As amostras foram analisadas em citômetro de fluxo (FACscalibur da Becton & Dickinson, San Jose, CA, EUA) no canal FL2-H. Os resultados obtidos foram processados utilizando o programa CellQuest (Becton & Dickinson) avaliando 20.000 eventos por amostra.

O tampão hipotônico, ou de lise, rompe a membrana celular permitindo que o iodeto de propídeo se ligue ao DNA, intercalando-se entre as bases. Ao ligar-se ao DNA de células íntegras, o iodeto de propídeo emite fluorescência alta, e quando da ligação a fragmentos de DNA de células não íntegras há emissão de fluorescência baixa (ZAMAI et al., 1996).

4.6.1.5 Análise do conteúdo de DNA celular

O efeito dos tratamentos sobre a proliferação celular foi avaliado por meio da análise do conteúdo de DNA. As células (1,5 x 105 células/mL), em meio de cultivo RPMI 1640 com 10% de SFB, foram semeadas em placas de 24 poços. Após 24 h sob condições de cultura, foram adicionados os tratamentos nas concentrações de 3, 30 e 300 µg.mL-1 em meio de cultivo RPMI 1640 com 10% de SFB e as placas foram levadas a incubação por 48 h a 37ºC em estufa com atmosfera úmida e 5% de CO2. Após esse período, as suspensões de células referentes a cada tratamento foram coletadas e centrifugadas a temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado e, sobre o precipitado celular, foi adicionada uma solução de difenilamina (1,5% em ácido acético e 0,1% de acetaldeído) e mantido em contato com o precipitado pelo período de 24 h ao abrigo da luz. Determinou-se a absorbância a 575 nm em espectrofotômetro (SELLITTI et al., 2001). Os resultados foram expressos em porcentagem de conteúdo de DNA celular. Meio RPMI 1640 com 10% de SFB e vincristina a 40 nmol.L-1 foram empregados como controles negativo e positivo, respectivamente.

4.6.1.6 Análise de ciclo celular por citometria de fluxo

Para analisar se houve alteração do ciclo celular, foi executado o protocolo descrito por Nicoletti e colaboradores (1997), conforme descrito no item 4.6.1.4. Nesse sentido, avaliou-se a porcentagem de células em diferentes fases do ciclo celular. As amostras foram analisadas em citômetro de fluxo (FACscalibur da Becton & Dickinson, San Jose, CA, EUA) no canal FL2-H. Os resultados obtidos foram processados utilizando o programa CellQuest (Becton & Dickinson) avaliando 20.000 eventos por amostra.

4.6.2 Cultura das demais células de origem tumoral

HeLa – Modelo de células epiteliais de carcinoma de cérvix uterino humano - As células HeLa são oriundas de uma paciente com carcinoma epidermóide da cérvix uterina (KLEIN et al., 1999).

B16F10 - Modelo de melanoma murino - As células B16F10 são melanócitos extraídos a partir de melanoma de pele de camundongos.

J774A.1 – Modelo de macrófagos de origem tumoral - J774A.1 são células imortalizadas, linhagem de modelo de macrófagos derivados de sarcoma de células reticulares de ascite de camundongo, largamente empregadas para avaliação de atividade imunomoduladora in vitro.

A citotoxicidade dos diferentes tratamentos frente às células tumorais foi avaliada pelo ensaio de viabilidade celular empregando-se o método de redução do MTT.

4.6.2.1 Ensaio de viabilidade celular pelo método de redução do MTT

As células, em meio RPMI 1640 contendo 10% de SFB, foram semeadas em placas de 96 poços (0,25 x 105 células/poço) e mantidas sob condições de cultura por 24 h. Na sequência, foram adicionadas diferentes concentrações (3, 10, 30, 100 e 300 µg/mL) das amostras sobre as células aderidas. Essas concentrações foram obtidas a partir da diluição das amostras em meio de cultivo RPMI 1640 com 10% de

SFB. As células foram incubadas por 24, 48 e 72 h consecutivas a 37ºC em estufa com atmosfera úmida e 5% de CO2. Após o período de incubação, o sobrenadante foi desprezado e às células foi adicionada uma solução de MTT a 0,5 mg.mL-1. Em seguida, as culturas foram incubadas a 37ºC durante 30 min, ao abrigo da luz, até a observação da presença dos cristais de formazan. Para a solubilização dos cristais de formazan, dimetilssulfóxido (DMSO) foi acrescentado e a leitura espectrofotométrica da absorbância, em comprimento de onda de 550 nm, foi realizada em leitor de placas (Biotek, µQuant).